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30.05.20161 SDS-PAGE Experimentelle Vorgehensweise.

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Präsentation zum Thema: "30.05.20161 SDS-PAGE Experimentelle Vorgehensweise."—  Präsentation transkript:

1 SDS-PAGE Experimentelle Vorgehensweise

2 Untersucht werden Muskelproben z.B. von Fischen auf: deren Proteinzusammensetzung das Molekulargewicht der Muskelproteine die Verwandtschaftsbeziehungen zwischen den untersuchten Species Ziel des Experiments

3 Minuten:Experimentvorbereitung (in Theorie und Praxis ) Praxis 90 Minuten:Proteinextraktion und PAGE 60 Minuten:Färben des Gels (außerhalb des Unterrichts) Über Nacht:Entfärben des Gels 45 Minuten:Gelauswertung Dauer des Experiments

4 Experimentvorbereitung Besorgen der Fischmuskelproben (durch die Schüler) (jeweils kleine Stücke sind in der Regel kostenlos erhältlich) Auch Krabben, Muscheln usw. sind zur Unter- suchung geeignet Verteilen der Proben, dabei auf die Beschriftung achten! (2 Arbeitsgruppen verteilen Stücke von jeweils 3 Species)

5 Experimentvorbereitung Der konzentrierte Tris/Glycerin/SDS-Puffer (TGS) im Kit (1 L) wird mit H 2 O dest. 1 : 10 verdünnt. Pro Kammer werden 350 ml des verdünnten Puffers benötigt. Ansatz: 35 ml konzentrierter TGS-Puffer ml H 2 O dest. (2 Arbeitsgruppen)

6 Experimentvorbereitung Aliquotieren der Coomassie-Färbelösung: Pro Arbeitsgruppe werden 70 ml Coomassie-Färbelösung aliquotiert und verteilt

7 Experimentvorbereitung Aliquotieren des Lämmli-Puffers: Pro Arbeitsgruppe werden 1,6 ml Lämmli-Puffer in ein 2 ml Eppendorftube pipettiert. (reicht für 6 Proben) Komponeneten des Lämmli-Puffers: Tris, SDS, Glycerin, Bromphenolblau (ß-Mercaptoethanol)

8 Experimentvorbereitung Aliquotieren des vorgefärbten Kaleidoskop- Standards: 11 µl pro Arbeitsgruppe

9 Experimentvorbereitung Rehydratisieren und aliquotieren des Actin- Myosin-Standards: - Ins Gefäß des lyophilisierten Standards 500 µl Lämmli-Puffer pipettieren - 5 Min. bei 20 o C inkubieren - für jede Arbeitsgruppe werden 12 µl in ein beschriftetes Reaktionsgefäß mit Schraubverschluss pipettiert und verteilt

10 Experimentvorbereitung Wasserbad auf 95 o C erhitzen 95°C

11 Je ein Eppendorftube wird mit dem Namen der vorhandenen Fischproben beschriftet 1. Probenvorbereitung

12 Probenvorbereitung 1.2In jedes Tube werden 250 µl Lämmli- Puffer pipettiert

13 Proteinextraktion 2.1Von jeder Fischmuskelprobe wird ein ca. 1 g schweres Stück (Würfel mit Kantenlänge ca. 3 mm) abge- schnitten und in das entsprechend beschriftete Tube überführt.

14 Proteinextraktion 2.2Nach kurzem Vortexen werden die Proben 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert Während der Inkubation werden Schraubtubes mit den Namen der Fischspezies beschriftet

15 Proteinextraktion 2.3Nach der Inkubation werden 18 µl des Protein-Puffergemisches aus den Tubes in die entsprechend beschrif- teten Gefäße mit Schraubverschluss pipettiert 18 µl ohne Fischmuskelstücke!

16 Proteinextraktion 2.4Die Proben, sowie der Actin-Myosin- Standard, werden 5 Minuten bei 95°C im Wasserbad erhitzt. 95°C

17 Aufbewahrung der Proben  Die Proben können nach Erhitzen im Wasserbad für 3-4 Stunden bei Raumtemperatur gelagert oder bei –20°C über mehrere Wochen aufbewahrt werden

18 Vorbereiten der Elektrophoresekammer 3.3Mit Rasierklinge/Skalpell die Klebefolie der Gelkassette entlang der markierten unteren Linie einschneiden und den unteren Streifen abziehen

19 Vorbereiten der Elektrophoresekammer 3.1Die Verpackung des Fertiggels entlang der vorgegebenen Linie aufschneiden und die Gelkassette entnehmen 3.2Kamm ziehen Einkerbungen nutzen!

20 Vorbereiten der Elektrophoresekammer 4.1 Die Gelkassette mit der kürzeren Platte nach innen gerichtet in den Elektrodenstand einsetzen Auf der gegenüberliegenden Seite eine weitere Gelkassette oder eine Blindplatte einsetzen 4.2 Den Elektrodenstand im Klammerrahmen nach unten drücken und die 2 Klemm- klappen schließen 4.3Klammerrahmen mit Elektroden- stand in den Pufferbehälter setzen

21 Befüllen der Kammer mit Puffer 5.1Den Elektrodenstand mit 140 ml verdünntem TGS-Puffer füllen 5.2Den Pufferbehälter ebenfalls mit 200 ml TGS-Puffer füllen

22 Vorbereiten der Elektrophoresekammer Tipp: Läuft der Puffer aus dem Klammerrahmen aus, diesen entnehmen, Puffer entfernen und Elektrodenstand erneut festklemmen. Läuft dennoch Puffer aus, kann der Pufferbe- hälter auf die gleiche Höhe mit Puffer wie im Elektrodenstand gefüllt werden.

23 Befüllen der Geltaschen Geltaschen Die Geltaschen werden befüllt mit: - 10 µl Probelösung (P1 – P5) - 10 µl Actin-Myosin-Standard (AM) - 10 µl Kaleidoskop-Längenstandard (KL) Reihenfolge von links nach rechts: AM KS P1 P2 P3 AM KS P4 P5 P6

24 Durchführung der Elektrophorese Die Gelkammer schließen und die Elektro- phorese bei 200 V starten Die Elektrophorese wird beendet, wenn Brom- phenolblau die untere Kante des Gels erreicht hat (Dauer: ca. 25 Minuten).

25 Entnahme des Gels 8.1Den Klammerrahmen aus dem Pufferbehälter entnehmen und den Puffer dekantieren (Puffer ist wieder verwendbar) 8.2Die Gelkassette aus dem Elektro- denstand entnehmen und mit der kurzen Platte nach oben abgelegen

26 Entnahme des Gels 8.3Die Klebefolie an den Seiten der Gelkassette ent- lang der weißen Linien ein- schneiden.

27 Die obere Gelplatte abheben 9.2Zum Entfernen des SDS, die untere Gelplatte mit dem Gel 5 Minuten in eine Wasser gefüllte Färbeschale legen. Gel unter Wasser von der Platte ablösen. 9.3Wasser durch 70 ml Coomassie-Lösung ersetzen und eine Stunde darin färben. 9. Anfärben des Gels

28 Entfärben des Gels 10.1 Färbelösung nach einer Stunde dekantieren Gel mehrere Stunden unter fließendem Wasser (evtl. über Nacht) entfärben bis der Gelhintergrund farblos ist.

29 Gelauswertung 11.1Stellen Sie die Unterschiede zwischen den untersuchten Species hinsichtlich der Zusammensetzung ihrer Muskel- proteine fest. 11.2Bestimmen Sie das Molekulargewicht von zwei Proteinen anhand einer Eich- kurve.

30 Ergebnis der SDS- Gelelektro- phorese -- P1 P2 P3 P4 P5 AM KS AM: Actin- u. Myosinstandard; KS: Kaleidoskop-Standard; P1 – P5: Fischmuskelproben kD Myosin Actin Tropo- myosin

31 Mathematische Auswertung der Gelelektrophorese Erstellen einer Eichkurve mit Hilfe des Protein- Standards: Abmessen der Wegstrecken zwischen Tasche und Protein- Banden. ( Gemessen wird jeweils zwischen Unterkante Geltasche und Bandenmitte)

32 Mathematische Auswertung der Gelelektrophorese Messwerte [mm] des Standards in die Tabelle einfügen. Proben vermessen und in die dafür vorgesehene Excel- Tabelle eingetragen. Zur Excel Auswertung


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