Lipide.

Präsentation zum Thema: "Lipide."—  Präsentation transkript:

1 Lipide

2 Grundlagen Was sind Lipide? Arten und Funktionen von Lipiden
Glycerophospholipide Mono-, Di- und Triglycerine Ergosteriol und Ergosterylester Freie Fettsäuren Sphingolipide Isolierung Auftrennung Wieso 2D DC? Nachweis

3

4 Arbeiten mit radioaktiven Substanzen
Eigener Bereich für radioaktives Arbeiten Art der Strahler Umgang mit radioaktiven Substanzen Substanzen gesondert entsorgen Nach abgeschloßener Arbeit: Dekontamination des Arbeitsplatzes

5 Durchführung

6 Vorbereitung der Hefekultur
Zellkonzentration mittels OD bestimmen Zellen in Minimalmedium vorinkubieren

7 Zugabe von 1-14C-Palmitinsäure
Lösung inkubieren BSA-Lösungzugeben Zellpellet waschen

8 Aktivität der Fraktionen bestimmen
Zellen aufschließen Lipide extrahieren Mittels DC auftrennen Aktivität der Fraktionen bestimmen

9 Durchführung des Aktivitätsassays
Vorbereitung des Reaktionsansatzes Zuagen von Stopplösung nach 0, 10, 20 Minuten Bestimmen der Aktivität

10 Spezifische Aktivität der Palmitinsäure Theoretische Totalaktivität
Berechnungen Zählausbeute Probe Cocktail cpmLE cpmBW dpmLE dpmBW cpm*/dpm* %Zählausbeute 6 Safety Cocktail MW Probe 6 MW Probe 9 (Probe6-Probe9)/(Probe6-Probe9) cpm*/dpm*100 7 Safety Cocktail + H2O MW Probe 7 MW Probe 10 (Probe7-Probe10)/(Probe6-Probe9) 8 Safety Cocktail + H2O + Kieselgel MW Probe 8 MW Probe 11 (Probe8-Probe11)/(Probe6-Probe9) Spezifische Aktivität der Palmitinsäure GBq/mmol dpm/mmol cpm/mmol 2,1 2,1*60 *10^9 dpm*Zählausbeute Theoretische Totalaktivität MBq/100ml fV dpm/10ml 37 10 37*60/fV*10^6 Bilanz Probe Messvolumen µl cpm/Messung cpm*/Messung Gesamtvolumen ml Gesamtaktivität dpm Totalaktivität 100 MWProbe 1 Probe1-Probe6 10,1 cpm*/Zählausbeute*Messvolumen/Gesamtvolumen Medium MWProbe2 Probe2-Probe6 11 Waschwasser1 MWProbe 3 Probe3-Probe6 5 Waschwasser2 MWProbe 4 Probe4-Probe6 10 Zellen MWProbe 5 Probe5-Probe6

11 theorethische Konzentration 37000*60*1000/10,1/132000000 µmol/l
Aufnahmerate theorethische Konzentration 37000*60*1000/10,1/ µmol/l tatsächliche Konzentration cpm*Totalaktivität/Zählausbeute*10000/ Zellkonzentration 1 mg/ml Inkubationszeit 10 min Einbau GesamtaktivitätZellen/GesamtaktivitätTotalaktivität*100 % GesamtaktivitätZellen/100*Zählausbeute cpm*/(mg*min) GesamtaktivitätZellen/100 dpm*/(mg*min) GesamtaktivitätZellen/100/1,32*10^8 nmol/(mg*min) Gesamtlipide cpm cpm* % AktivitätLSC % Gesamtaktivität Phospholipide MW MW-BW MW-BW/Summe MW-BW MW-BW/MW-BW Diacylglycerine freie Fettsäuren Triacylglycerine Sterolester Summe Summe MW Summe MW-BW Summe=100% Summe MW-BW/MW-BW Gemessene Gesamtaktivität

12 Gemessene Gesamtaktivität
Phospholipide cpm cpm* % Aktivität 1.Dim % Aktivität 2.Dim % Gesamtaktivität PC 2421 2345 42,6 30,8 28,8 PS 481 405 7,4 5,3 5,0 PI 1958 1882 34,2 24,8 23,1 PE 826 750 13,6 9,9 9,2 DMPE 57 0,0 PA 439 363 6,6 4,8 4,5 LP 152 76 1,4 1,0 0,9 CL 25 FS 536 460 8,3 6,1 5,6 JVL 1398 1322 24,0 17,4 16,2 Summe 8293 7603 138,0 100,0 93,4 Gemessene Gesamtaktivität 8219 8143

13 Anfangsgeschwindigkeit
Serin konz. Ci/ml Ci/mmol Bq/mmol dpm/mmol 0,001 29,5 1,0915E+11 6,549E+12 1Ci 3,7E+10Bq Anfangsgeschwindigkeit zeit dpm mmol nmol nmol*f 173 2,64E-11 2,64E-05 0,01 MW MW/6,55E+12 mmol *E+6 nmol*442,25 10 11976 1,83E-09 0,00183 0,81 MW/6,55E+13 20 29808 4,55E-09 0,00455 2,01 MW/6,55E+14

14 Diskussion

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18 Aktivitätsassay