Grundlagen der Durchflusszytometrie

Präsentation zum Thema: "Grundlagen der Durchflusszytometrie"—  Präsentation transkript:

1 Grundlagen der Durchflusszytometrie

2 Gliederung Was ist ein Durchflusszytometer?
Teile eines Durchflusszytometers Flüssigkeitssystem Optik Elektronik Computer Instrumentsettings Beispielsmessung

3 Diese Partikel haben etwas gemeinsam
. Blood cells Chromosomes Algae Protozoa Einige ihrer Eigenschaften können mit Hilfe der Durchflusszytometrie gemessen werden. 1

4 Was ist ein Durchflusszytometer?
Grundlegend ist ein Durchflusszytometer ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop. (Erste Prototypen sahen auch so aus)

5 Das automatisierte Mikroskop
Waste Detector & Counter Sample Diese einfache Darstellung zeigt das Grundprinzip eines Durchflusszytometers: Zellen werden in einer Durchflussküvette an einer Mikroskopoptik vorbei geführt.

6 Das Durchflusszytometer

7 Welche Parameter können gemessen werden?
die relative Zellgrösse (Forward Scatter - FSC) die Granularität oder innere Komplexität (Side Scatter - SSC) die Fluoreszenzintensität (FL1, FL2, up to FL X) 2

8 Teile eines Durchflusszytometers
Flüssigkeitssystem Liefert einen konstanten Hüllflüssigkeitsstrom Transportiert die Probe in die Küvette Fokussiert die Zellen im LASER-Strahl Optik Fokussiert das Anregungslicht Sammelt das emittierte Licht Elektronik Wandelt Lichtsignale in elektrische Signale um Sendet die Signale zum Auswerterechner Computer Stellt Daten graphisch dar Kontrolliert die „Instrument Settings“

9 Charakteristiken von FSC und SSC
Coherent lightsource (488 nm) Forward scatter Cell size (488 nm) Side scatter Granularity (488 nm) Forward scatter (FSC) gemessen entlang der Achse des einfallenden Lichtes proportional zur Zellgrösse / Zelloberfläche (nur bei runden Zellen) Side scatter (SSC) gemessen im 90° Winkel zum einfallenden Licht proportional zur Zellkomplexität und Granularität 3

10 Beispiel: Blut Granulozyten Side scatter Monozyten Lymphozyten Debris
Forward scatter 4

11 Fluoreszenz l=488 nm l=530 nm Excitation light Emission light Die Fluorochrome absorbieren die Energie des Anregungslichtes. Die absorbierte Energie wird abgegeben als: Schwingungsenergie und Wärme Emission eines Photons mit grösserer Wellenlänge ( = geringere Energie) 5

12 Fluoreszenzintensität Relative fluorescence intensity
FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC FITC Number of Events FITC FITC 101 102 103 104 Relative fluorescence intensity 6

13 Hydrodynamische Fokussierung
Sample Sheath 1

14 Optische Filter Longpass Shortpass Bandpass LP 500 SP 500 BP500/80
LP 500 SP 500 BP500/80 5

15 Octagon Detection System
PerCP-Cy5.5 FITC 695/40 655 LP SSC PE PE-Cy7

16 Digitalisiert die Signale
Elektronik Wandelt optische Signale (Photonen) in elektronische Signale (Spannungspulse) um Digitalisiert die Signale Analysiert die -Höhe [Height (H)], Weite [Width (W)] und die -Fläche [Area (A)] des Spannungspulses Übermittelt die Daten an den Auswerterechner 8

17 Entstehung eines Spannungspulses
Laser t Voltage 1. 2. 3. Voltage 9

18 Auswertung eines Spannungspulses
Pulse Area (A) Pulse Height (H) Voltage 40 Pulse Width (W) Time (µs) 12

19 Schwellenwert (Threshold)
Der Schwellenwert gibt die minimale Signalintensität an, die an dem jeweiligen Kanal erreicht werden muss. Alle Signale mit geringerer Intensität werden nicht dargestellt. 13

20 Zusammenfassung Während die Zellen den LASER-Strahl passieren, werden Spannungspulse am Photomultiplier generiert Das Signal wird verstärkt Die Elektronik digitalisiert das Signal mit einer Frequenz von 10MHz Nur Signale, die den gewünschten Schwellenwert überschreiten, werden analysiert und aufgezeichnet Die Daten werden letztlich zum Analyserechner übermittelt, der mit dem Zytometer verbunden ist 15

21 Instrumentsettings Die exakten Werte für PMT-Spannung und Schwellenwert hängen von der Applikation (Zelltyp, Färbemethoden und Probenvorbereitung) und dem jeweiligen Durchflusszytometer (optische Eigenschaften) ab Darstellung der Daten in linearer oder logarithmischer Skala ist in der Regel durch die Anwendung bedingt 1

22 Datenspeicherung Alle Daten werden direkt in eine interne Datenbank gespeichert. Jeder Plot ist mit dem entsprechenden Datenfile verbunden. Jedes Tube trägt eine Kopie der Instrumentsettings, die während der Aufzeichnung aktiv waren. Daher gibt es keine speziellen Speicherungsbefehle in der Software. Jede Aktion wird in der Datenbank aufgezeichnet. Beim Beenden und Neustarten der Software wird das letzte Experiment exakt an der Stelle geöffnet an der es verlassen wurde. 5

23 Darstellung der Daten 1 1) Histogramm - ein Parameter, der die Fluoreszensintensität als Häufigkeitsverteilung dargestellt 6

24 Darstellung der Daten 2 2) Dotplot (Punktwolkendarstellung) - zwei Parameter werden auf der x- und y-Achse dargestellt Listmode file FSC SSC FL1 FL2 Event 1 30 60 638 840 Event 2 100 160 245 85 Event 3 300 650 160 720 200 400 600 800 1000 840 FL2-H 85 200 400 600 800 1000 FL1-H 245 638 7

25 Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag:
Enough theory of flow! Nun ein Beispiel aus dem Laboralltag: 8

26 Aufgabe: Bestimmung des prozentualen Anteils an CD4+, CD3+ und CD8+ Zellen im Vollblut
Material Milzzellen aus der Maus Methode Drei-Farben-Immunfluoreszenz Preparation Färben von frisch isolierten Milzzellen Färbung Ungefärbte Kontrolle Einzelfärbungen für CD3-FITC, CD4-PE und CD8-APC, um die passenden Instrumentsettings zu bestimmen 9

27 Einstellung der FSC- und SSC-Spannung
FSC und SSC sind optimal eingestellt, wenn die zu untersuchende Population (z.B. Lymphozyten) von allen anderen Populationen zu unterscheiden ist Der Schwellenwert des FSC wird so eingestellt, dass Debris überwiegend von der Datenauswertung ausgeschlossen wird 11

28 Parameter (I) FSC und SSC n Abhängig vom Zelltyp und Zustand (naiv oder aktiviert) n Abhängig von der Präparationsmethode (z.B. Ficoll, Fixierungsmethode) n Werden normalerweise genutzt, um die zu untersuchende Population für weitere Untersuchungen zu definieren 12

29 Parameter (II) Fluoreszenzkanäle (FL1, FL2, FL3, FLX) n Abhängig von der Färbung (Konjugat, Antikörper, Propidium Jodid für DNA-Färbung, etc.) n Meistens dient die Fluoreszenz als Marker für die statistische Analyse 13

30 „Gating“: Bestimmen der gewünschten Population
14

31 „Gating“ Selektive Analyse definierter Zellpopulationen
Gates können manuell oder automatisch durch die Software gesetzt werden Zu kleine Gates können zum Verlust von Zellpopulationen führen Zu grosse Gates können die Zahl unerwünschter Zellen erhöhen 15

32 Einstellung der Fluoreszenzsettings
A) Einstellen der PMT-Spannung Probe: ungefärbte Kontrolle Die gemessene Fluoreszenz wird als unspezifische Autofluoreszenz betrachtet. Die Lymphozytenpopulation wurde vorher im FSC und SSC „gegated“. B) “Quadrantengating” Traditionell werden Quadranten benutzt um die 4 möglichen Populationen in einem 2-Farben-Experiment zu definieren. Bei Vielfarbenexperimenten ist diese Art des „Gatings“ nicht die optimale Lösung. 1

33 „Quadrantengating“ FITC + PE negative Q2 Q4 Q3 Q1 FL2-H FL1-H 2

34 Fluoreszenzüberstrahlung
650nm 700nm 500nm 550nm 600nm Relative Intensität Wellenlänge ( n m ) FL1 530/30 FL2 585/42 3

35 FITC-Kompensation Detektor - … % Signal FL1 FL2 530/30 585/42
Relative Intensität 550nm 600nm 650nm 700nm 500nm Wellenlänge (nm) 4

36 FITC-Kompensation Lowering the FITC-population is achieved by...
... Subtracting a percentage of FITC- intensity from the affected PE-channel ... FL1 530/30 FL2 5 8 / 4 2 … because 25% of the FITC-signal are actually detected in the PE channel ... Relative Intensity 500nm 550nm 600nm 650nm 700nm Wavelength (nm) 5

37 Zusammenfassung FSC und SSC werden so eingestellt, dass die Population gut von anderen Populationen zu unterscheiden ist Die gewünschte Population wird „gegatet“ Die PMT Spannungen der Fluoreszenzkanäle werden mit der ungefärbten Kontrolle eingestellt Einzelfärbungen werden eingemessen um Fluoreszezüberstrahlungen zu kompensieren