Synthetische Biologie und Nanosysteme * ausgewählte Beispiele * Vorlesungsreihe "Biophysik der Systeme" 2008-02-06 ingmarschoen@physik.uni-muenchen.de

Ausrichtung der Forschung Fortschritte in Sequenzierungstechnik DNA-/Gensynthese Mikrofluidik de novo Design biologischer Systeme Verständnis Anwendung Reduktion der Komplexität Minimale Zelle induzierbare Reaktion chemischer/optischer Stimulus Transkriptionsbasierte Schalter und Oszillatoren Metabolic Pathway Engineering Synthese/Abbau chemischer Substanzen gerichtete Evolution Protein Engineering Erweiterung des genetischen Codes nicht-natürliche Aminosäuren logische biochemische Netzwerke molekulare Biocomputer selbstorganisierte Strukturen DNA/RNA als Template DNA Maschinen

Ausrichtung der Forschung Fortschritte in Sequenzierungstechnik DNA-/Gensynthese Mikrofluidik de novo Design biologischer Systeme Verständnis Anwendung Reduktion der Komplexität Minimale Zelle induzierbare Reaktion chemischer/optischer Stimulus Transkriptionsbasierte Schalter und Oszillatoren Metabolic Pathway Engineering Synthese/Abbau chemischer Substanzen Seminar 12.12.07 gerichtete Evolution Protein Engineering Erweiterung des genetischen Codes nicht-natürliche Aminosäuren logische biochemische Netzwerke molekulare Biocomputer selbstorganisierte Strukturen DNA/RNA als Template DNA Maschinen

bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor Beispiel 1: Chemotaxis in E. coli bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor Umdesign Signalweg

Chemotaxis in E. coli CheZ reguliert Dephosphorilierung von CheY: Topp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007) CheZ reguliert Dephosphorilierung von CheY: ermöglicht Rotation gegen UZS  Mobilität geradlinige Fortbewegung Taumeln WT DCheZ

Chemotaxis in E. coli Topp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007) Riboswitches kontrollieren die Genexpression abhängig von Liganden

Chemotaxis in E. coli DCheZ kombiniert mit Riboswitch: Topp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007) DCheZ kombiniert mit Riboswitch:  Mobilität abhängig von Ligandenkonzentration

Chemotaxis in E. coli konzentrationsabhängige Mobilität Topp & Gallivan, JACS 129: 6807 (2007) konzentrationsabhängige Mobilität  Migration entlang Gradienten zu höherer Konzentration ("Pseudotaxis")

bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor Beispiel 2: Lichtgesteuerte Expression in E. coli bestehender Signalweg, Sensitivität auf neuen Effektor Neudesign Rezeptor

Lichtgesteuerte Expression in E. coli Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005) Phytochrom: Chimäre aus 2 Modulen - extrazellulärer Photorezeptor (Cph1 aus Cyano-Bakterium Synechocystis) intrazellulärer Regulator (EnvZ aus E. coli, zuständig für osmotische Regulation) Transformation in DEnvZ E. coli für die Synthese von PCB in E. coli: ho1 und pcyA Gene aus Synechocystis Cph1 EnvZ on off

Lichtgesteuerte Expression in E. coli Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005) Selektion Chimäre Cph8 mit hohem hell-dunkel "Kontrast" +EnvZ Belichtungszeit: 4h bei 37°C

Lichtgesteuerte Expression in E. coli Levskaya et al., Nature 438: 441 (2005)  räumliche Kontrolle der Genexpression  Auflösung: 108 Bakterien (Pixel) pro square inch

Beispiel 3: Gerichtete Evolution Mutation Selektionsdruck verbesserte Variante Ausgangsprotein bestehendes Protein veränderte Funktionalität

Gerichtete Evolution Erzeugung der Bibliothek (107-1010) - Mutagenese einer Oligonukleotid-Kassette fehleranfällige PCR Umklonierung in Plasmid und Transformation z.B. in E. coli  Genpool Kopplung von Phenotyp und Genotyp Affinität: Phage display oder Yeast cell display Funktionalität: E. coli, in vitro Kompartimentisierung Antigen Selektion und Screening Affinität: über Antigen Funktionalität: FACS (fluorescent activated cell sorting)

Gerichtete Evolution in vitro Kompartimentisierung: Wasser-in-Öl-(in-Wasser) Emulsionen kleine Reaktionsvolumina: hohe Konzentration, schnelle Kinetik 1010 pro ml: hoher Durchsatz Selektionsdruck frei wählbar kompatibel mit Mikrofluidik, FACS: 107 pro h Mastrobattista et al., Chem. Biol. 12: 1291 (2005)

Gerichtete Evolution: Anwendungen typischerweise 6-12 Runden Biokatalysatoren - veränderte Substratspezifität veränderte/verbesserte Enantioselektivität - erhöhte Aktivität (50x) in unnatürlichem Reaktionsmilieu - erhöhte Thermostabilität (+15°C) Antikörper Affinitätssteigerung 10-100x Affinität für neues Antigen: 100-1000x schlechter als in der Natur

Beispiel 4: Erweiterung des genetischen Codes Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren in Proteine

Erweiterung des genetischen Codes stellenspezifisch, cotranslational anstatt der natürlichen AS Standard-Code

Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006) Anforderungen: orthogonales tRNA-Codon Paar orthogonale aminoacyl-tRNA-Synthetase nnAS im Cytosol

Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006) amber stop codon (UAG) supression orthogonales tyrosyl-tRNA/tyrosyl-RS Paar aus Methanococcus janaschii gerichtete Evolution der tRNA in E. coli mit negativ/positiv-Selektion gerichtete Evolution der Substratspezifität der RS negativ: Orthogonalität zu endogenen Synthetasen (sonst Zelltot durch Expression von Barnase) orthogonal oder nicht funktionell positiv: mit Synthetase (Expression sonst Zelltot)  Orthogonal + Funktionell ins Translation

? Ribosomaler Einbau nicht-natürlicher Aminosäuren Wang et al., Annu. Rev. Biophys. Biolmol. Struct. 35: 225 (2006) ? Fluorescein

Durchführung logischer oder kombinatorischer Rechenoperationen Beispiel 5: DNA Computing Durchführung logischer oder kombinatorischer Rechenoperationen mithilfe von DNA Sequenzen

DNA Computing Kombinatorisches Problem Hamiltonscher Pfad in Graph Adleman, Science 266: 1021 (1994) Kombinatorisches Problem Hamiltonscher Pfad in Graph Existiert ein Weg von 0 nach 6, der alle Knoten genau einmal durchläuft?

DNA Computing Kombinatorisches Problem Hamiltonscher Pfad in Graph Adleman, Science 266: 1021 (1994) Kombinatorisches Problem Hamiltonscher Pfad in Graph Algorithmus 1. Generation zufälliger Wege 2. Auswahl Pfade von 0 nach n 3. Auswahl Pfade mit n Knoten 4. Auswahl Pfade, die alle Knoten durchlaufen 5. "wahr" / "falsch"

DNA Computing Knoten und Kanten 20mer DNA Adleman, Science 266: 1021 (1994) 2 1 3 Knoten und Kanten 20mer DNA Algorithmus 1. Ligation 2. PCR mit Primer O0 und O6 3. Agarose-Gel: Bande mit 140bp 4. Affinitätsselektion von ssDNA mit O1,…,O5 5. Probe: PCR mit O0 / O1, O0 / O2,…, O0 / O6

Logische biochemische Netzwerke Seelig et al., Science 314: 1585 (2006) boolsche Logik "0": niedrige Konzentration "1": hohe Konzentration in out AND

Logische biochemische Netzwerke Seelig et al., Science 314: 1585 (2006)

Logische biochemische Netzwerke Zhang et al., Science 318: 1121 (2007) Signalverstärkung - kinetisch inhibiert (Zeitskala Experiment) - Katalysator (Input) beschleunigt Reaktion um 104 - Entropie-getrieben

Beispiel 6: DNA Maschinen Spielerei?

DNA Maschinen DNA-Läufer entlang DNA-Schiene Unidirektionalität durch Treibstoff Restriktionsenzym Treibstoff Abfall Bath & Turberfield, Nat. Nanotech. 2: 275 (2007) Yin et al., Nature 451: 318 (2008) Unidirektionalität durch Zugabe der Treibstoffstränge in definierter Reihenfolge Zerstörung der Schiene Passivierung der Schiene durch Treibstoffstränge