VTEC in Rohmilchkäse – was nun? 5. Juni 2008 Jörg Hummerjohann, Dr. sc.nat.

Ausgangslage 2 Chargenrückrufe in D wegen VTEC in Schweizer Halbhartkäse (Schnittkäse) aus Rohmilch innerhalb 6 Monaten Keine Krankheitsfälle bekannt „Normale“ E. coli nicht nachweisbar Kein VTEC-Kriterium in EU VO 2078/2005 2 Einträge im EU-Schnellwarnsystem RASFF 40 t Ware (inkl. Hartkäse) blockiert bei Grenzkontrollen nach Österreich

Inhalt VTEC: Einführung zu den Keimen, ihrer Pathogenität & ihrem Vorkommen in Lebensmitteln Diverse VTEC-Nachweis-Methoden Lebensmittelrechl. Beurteilungen und Differenzen im europäischen Vollzug Konsequenzen für Rohmilchkäse-Produktion Aktivitäten der Forschungsanstalt ALP

Wichtige Referenzen CRL VTEC: www.iss.it/vtec/index.php EFSA Journal (2007) 579, 1-61 Monitoring of VTEC and identification of human pathogenic VTEC types: Scientific opinion of the panel on biological hazards Kaper et al. (2004), Nature Rev. 2:123-140 Karch et al. (2005), IJMM 295, 405-418 Bülte & Goll (2006): Escherichia coli und Shigellen, Behr‘s Verlag, Hamburg

Pathogene E. coli: Begriffsverwirrung EPEC EAEC EIEC UPEC STEC ETEC VTEC DAEC EHEC O136:H16 stx1- & stx2+ MNEC O26:H11 O157:H7 eae-Gen

Verotoxin-bildende E. coli (VTEC = STEC) Verozellen-Kultur + Toxin VT1 = Shiga-like toxin (Stx1) & VT2 (Stx2) aus: Caprioli (2006)

EHEC sind eine spezielle Untergruppe der VTEC/STEC Aus: Caprioli, CRL VTEC (2006)

EHEC binden durch Intimin/Tir an Darmepithelzellen und setzen Stx frei Aus : www.bms.ed.ac.uk/

Eigenschaften von E. coli O157:H7 - Prototyp der EHEC- hochpathogen; verursacht Ausbrüche seit 1982 jährliche Inzidenz aller EHEC-Erkrankungen: ca. 1.4/100000 Einw. [Salmonella: 82/100000; RKI 2006] infektöse Dosis <100 Keime resistent gegenüber Säure und Einfrieren Glucuronidase-negativ (negativ auf TBX-Agar!) Spiking-Experimente: überlebt in streichfähiger Rohwurst und in Rohmilchkäse (Stiebing, 2000; Reitsma, 1996) Achtung: Punkte gelten nicht automatisch für alle VTEC

Aus: Caprioli (2006)

Gene für Intimin, Rezeptor und Sekretionssystem sind auf der LEE-Pathogenitätsinsel lokalisiert Aus: Caprioli (2006)

Aus: Caprioli (2006)

Verlauf EHEC-Erkrankung Inkubationszeit: 2-10 Tage Mehrzahl: wässriger Durchfall 10-20%: HC* 5-10%: HUS* oder TTP* Letalität HUS: 2% Auch Symptomlosigkeit! *HC = hämorrhagische Colitis HUS = hämolytisch-urämisches Syndrom TTP = thrombotisch-trombocytopenische Purpura Aus : Gyles (2007) und RKI (2008)

Aus: Caprioli (2006)

Verteilung v. VTEC O157 und non-O157 in EU Aus EFSA (2007)

Symptome bei O157- und non-0157 Fällen & „Rangliste“ der Serotypen bei HUS

Einteilung in Seropathotypen nach Karmali: Basis für Risikobeurteilung durch EFSA und für CEN-Norm „Detection of VTEC in food“ O157 u.a. : es gibt auch nicht-toxigene Isolate O26: H11 (stx1+ & eae+) => oft nur milder Durchfall O26: H11 (stx2+ & eae+) => oft HUS O91:H21 => Obwohl eae-negativ HC/HUS möglich => Nie Serotypisierung ohne stx- und eae-Bestimmung

Einteilung in Seropathotypen: Suche nach dem einen ( Einteilung in Seropathotypen: Suche nach dem einen (?) „magic predictive marker“ alternative Einteilung nach stx2-Varianten (Scheutz & Strockbine, 2005; Friedrich, 2002) => Serotypen-unabhängig Screening nach neuen Pathogenitätsfaktoren, mittels Genomics z.B. Karmali (2003), Coombes (2008) Seropathotypen-Konzept (EFSA, 2007): „wertvoll“ „noch zu verfeinern“ „Zurzeit nicht möglich, humanpathogene VTEC vollständig zu definieren“

VTEC: Reservoire & Transmissionsrouten Auf Farmen und in Schlachthöfen wimmelt es von diversen VTEC in Faeces, in Umgebungsproben, auf Schlachtkörpern Rinder scheiden VTEC symptomlos aus Bis ca. 40% der Rinderkotproben positiv; O157 in CH nicht dominant (Bülte & Goll, 2006; Fremaux et al. 2006) Aus: Gyles (2007)

Beispiele für VTEC-Ausbrüche Oktober 2007 (www.ecoliblog.com): 30 Personen erkrankt in 8 US-Bundesstaaten, 0 Tote Rückruf von 9000 t gefrorenen, rohen Hamburgern Fabrik geschlossen (81 Pers. entlassen)

VTEC-Ausbrüche durch Rohmilchkäse seltener als bei Fleischprodukten klassische EHEC dominieren Käsetyp & Umstände leider oft unklar Tendenz: Frisch/Weichkäse

Fallkontrollstudie sporadischer VTEC-Erkrankungen in D: Werber et al 202 Fälle (Median: 2.5 J.); 5 Fälle mit HUS (3x O157); 85% VTEC non-O157 Risikofaktoren für Kinder < 3 J.: Kontakt zu Wiederkäuern, wichtigster Faktor (OR=9.3) Spielen im Sandkasten (OR = 2.6) Konsum von Rohmilch (OR = 6.9; einziges „Lebensmittel“) Risikofaktoren für Kinder zwischen 3 und 9 J. Spielen im Sandkasten (OR = 9.0) „Privates“ Baden in Seen, Planschbecken etc (OR = 3.8) Risikofaktoren für Personen >10 J. Konsum von Lammfleisch (OR = 14.1) Konsum streichfähiger Rohwürste (OR = 3.2) Schlussfolgerungen: Direkte Übertragung durch Lebensmittel spielt für Kinder <3 J. (grösstes Risiko für VTEC-Infektion und HUS) eine geringe Rolle Grosses Potenzial für Prävention (Händewaschen, kontr. Tierkontakt, Lm etc.)

Epidem. Daten zu EHEC in CH, 1996 -2006: Beobachtungen (Baumgartner & Schmid, 2008): Auslandsreise (62.7% der Fälle mit bekanntem Aufenthaltsort) Wohnen in ländlicher Umgebung Fäkal-kontaminiertes Trinkwasser 24 HUS-Fälle im Sommer 2003: Badegewässer etc. HUS durch ungenügend erhitztes Fleisch & Genuss von Rohmilch Empfehlungen zur Prävention: Keine Rohmilch trinken (Rohmilch gilt in CH als nicht genussfertig) Regeln zum Umgang mit rohem Fleisch beachten gute individuelle Hygiene, bes. auf Auslandsreisen Personen mit Durchfall dürfen keine Lebensmittel zubereiten

Bestimmung von VTEC in Lebensmitteln (D) nach: § 64 LFGB, L 07.18-1:2002 für Hackfleisch & Umgebungsproben auch: § 64 LFGB, L 00.00-92:2006 (DIN 10118:2004) für alle Lebensmittel, mit Toxinnachweis & Immunoblot 25g Lm & Anreicherung & Ausplattierung stx-PCR Koloniehybridisierung Isolat: biochem. Bestätigung Kein Isolat + - + „VTEC nachweisbar“ „VTEC nicht nachweisbar“ Vorteil: detektiert Virulenzfaktoren unabhängig vom Serotyp Nachteile: z.T. sehr niedrige Isolationsraten; Gene ≠ Toxine Achtung: Toxinnachweis mit induzierten Kolonien und nicht direkt im Käse wie bei SET

VTEC-Nachweis in Milch und Milchprodukten * PCR-Nachweis ohne Keim-Isolierung i.d.R. seltener als bei Fleischprodukten Stephan, 2007: nur Seropathotypen C-E, keine eae+ - Stämme, v.a. Produkte aus Hofverarbeitung & Alpkäsereien, aber auch aus Gewerbe

Differenzen zwischen VTEC-Isolaten aus Lebensmitteln und Patienten starke Heterogenität & versch. Serotypen in 1 Probe; häufig Zugehörigkeit zu den Seropathotypen C-E VTEC von HUS-Patienten (n=6) können auch mehr zytotoxisch als bovine Isolate von ident. Serotyp sein (Pradel et al, 2000) Nur 1.8% EHEC O26, O103, O157 in Lebensmittel, dagegen dominant in STEC-infizierten Patienten und eae-Gen in ca. 90% der HUS-Isolate (v.a. Kinder) und 5% der Lebensmittelisolate (Bülte & Goll, 2006; Beutin et al 2007) Ca. 50% der Isolate mit stx2/stx2d (davon 83% in Rindfleischproben) und Serotypen mit bekannten human-pathogenen Stämmen, zeigen Pathogenitätspotenzial auf, auch in Rohmilch (Beutin et al. 2007) Bestätigt Werber et al (2007): Lebensmittelübertragung spielt für Kinder <3J eine begrenzte Rolle und (Rind-)Fleischprodukte sind am kritischsten

Differenzen zwischen VTEC-Isolaten aus Lebensmitteln und Patienten Serogruppenzugehörigkeit & Virulenzaustattung zeigen Unterschiede zu humanen EHEC-Stämmen, typische EHEC werden selten isoliert (Pradel et al. 2000; Bülte, 2001; Beutin et al 2007) Hypothese (Bülte & Goll, 2006): „Auch wenn bislang nicht sicher bekannt ist, welche Eigenschaften einen VTEC- Stamm humanpathogen werden lassen, […] ist nur eine Subpopulation der VTEC als potenziell humanpathogen anzusehen“

VTEC-Methoden und Lebensmittelkontrolle (übrige EU) Umfrage während CEN/TC275/WG6 „Food microbiology“ Meeting in 7.-9.5.08, Helsinki

Differenzen zwischen VTEC-Methoden und Resultat-Interpretation: (1) Frankreich Aus: Perelle et al, 2007 (afssa-Methode, nicht im Vollzug eingesetzt)

Differenzen zwischen VTEC-Methoden und Resultat-Interpretation: (2) Deutschland 25g Lm & Anreicherung & Ausplattierung stx-PCR + Koloniehybridisierung - „Potentieller EHEC“ Isolat: biochem. Bestätigung Kein Isolat Weitere Charakterisierung: RKI Chargenrückzug Keine Beanstandung nach: § 64 LFGB, L 07.18-1:2002 für Hackfleisch & Umgebungsproben auch: § 64 LFGB, L 00.00-92:2006 (DIN 10118:2004) für alle Lebensmittel, mit Toxinnachweis & Immunoblot

Begründung & Ablaufschema Rückruf „alle VTEC = potentielle EHEC “ (BgVV 2001) Probe unsicher und geeignet, die Gesundheit zu schädigen Art. 14 Abs 1, 2a und 6 der VO (EG) Nr. 178/2002 Chargenrückzug => Möglichkeit zur Gegenanalyse falls ungenügend => Chargenrückruf Eintrag in europ. Schnellwarnsystem (RASFF)

Beispiel Schnittkäse-Isolat, welches im April 08 zum Rückruf führte Serotyp: O136:H16 => Macht dieser Keim krank? Pathogenitätsfaktoren: stx1:- stx2:+ => stx2 kann mit HC/HUS assoziiert sein eae: - => Kein klassischer EHEC e-hly: - Bovines Isolat, noch nie aus Patienten mit Durchfall oder HUS isoliert (Blanco et al, 2004; Midgley et al, 1999) Seropathotyp 5 (bislang ohne Hinweis auf Humanpathogenität)

Entwurf: VTEC-Referenzmethode der EU CEN/WG6 Projektleitung: S. Morabito (IT, CRL VTEC) und J. Boel (DK) Prinzip von Perelle et al (2007) übernommen, Änderungen: Anreicherung mit Novobiocin alles mit real-time PCR: (1) stx & eae; (2) Seropathotypen A & B offen für „neue EHEC“ (Beachtung der Populationsdynamik)

Entwurf: VTEC-Referenzmethode der EU Mögliche Resultatangaben (ohne lebensmittlrechtl. Interpretation): Verbindliche lebensmittlrechtliche Interpretation würde dann in einem neuen mikrobiol. Kriterium der VO (EG) 2073 erscheinen.

Wichtige Aussagen von EU-Gremien zu VTEC: (1) SCVPH (2003) Verwirrende Terminologie zur Definition humanpathogener VTEC führt Interpretations-Schwierigkeiten bei Prüfberichten Nur ein kleiner Teil aller VTEC-Isolate aus Tieren, Lebensmitteln und Umwelt ist humanpathogen Analyse auf VTEC O157 führt wahrscheinlich nicht zu einer bedeutenden Verringerung des Risikos für den Verbraucher Mikrobiolog. Leitlinien zu Verringerung der Fäkalkontamination entlang Lebensmittelkette könnten dazu beitragen Lm-Kategorien: rohes Rindfleisch, Hackfleisch, Rindfleischerzeugnisse, Rohmilch und Rohmilcherzeugnisse, Frischerzeugnisse bzw. Rohkost (bes. Sprossen & nicht-past. Säfte) Aus: Hatakka, 2006

Wichtige Aussagen von EU-Gremien zu VTEC: (2) EFSA (2006) Vollständige Definition humanpathogener VTEC z. Zt. nicht möglich Konzept „Seropathotypen“ wichtig für zukünftiges Risk Assessment; Konsensus der Definition suchen (CRL VTEC u.a.) Hauptvirulenzfaktoren : stx1, stx2, stx2c, eae (kein Konsens zu Charakt.) qualitative & quantitative VTEC-Standards sollten entwickelt werden „Gute Hygiene Praxis“ (Schlachthöfe & Lm-Produktion) ist effektivste Methode zur Veringerung dess VTEC-Gesundheitsrisikos. Indikatoren: Enterobacteriaceae & normale E. coli ausserdem: Anwendung effizienter validierter HACCP-Prozeduren Monitoring: starten mit O157, dann weitere wichtige Serogruppen

Massnahmen zu VTEC in der CH „Runder Tisch“ bei ALP: Treffen von Gesundheitsbehörde, Kant. Vollzug, Käseexporteur, Käseproduzent, Milchwirtschaftl. Berater, Labor-Fachleute offenes Gesprächsklima VTEC als Krankheitserreger ist sehr ernst zu nehmen Epid. Impact in CH durch Rohmilchkäse z.Zt. nicht relevant vorerst keine Änderung der Mikr. Kriterien & Lm-Kontrolle bei Ausbruch nachweislich durch Rohmilchkäse: evtl. Revision VTEC-Monitoring beibehalten Betriebliche Massnahmen treffen

Massnahmen zu VTEC in der CH Sensibilisierung der Käseproduzenten eingeleitet Betriebs-Analysen Produktspez. Analysen (Hhk A ≠ Hhk B) Massnahmen getroffen Miteinbezug der Rohmilchproduzenten sehr wichtig Vollzug bedauert, dass die Tolerenzwerte für E. coli in Käse wegen neuer HyV (Anpassung an 2073/2005) nun fehlen: 1000 KBE/g in Halbhartkäse 10 KBE/g in (Extra)Hartkäse

Halbhartkäse-Technologie führt zu keiner sicheren Abtötung von Pathogenen (bekannt) Listeria monocytogenes 1 2 3 4 5 6 7 Hartkäse (log cfu / ml, g) Hartkäse Halbhartkäse 8 Halbhartkäse (log cfu / ml, g) Milch Bruch Käse nach 1 d 7 d 30 d 60 d 90 d Brennen S. aureus Staphylococcus aureus E. coli Salmonellen Hartkäse aus Rohmilch sicher – Aber Achtung alles muss Stimmen (Säuerung, Wassergehalt, NaCl, ...) Halbhartkäse braucht mindestens 60 Tage Reifung Rel. Wiederstandsfähig ist auch Yersinia enterocolitica (Symbol: ausgefüllte Quadrate) Bachmann, 1995

Stufenkontrollen in 2 Halbhartkäse-herstellenden Betrieben auf E. coli Betrieb C: Daten fehlen Wichtigkeit Kessimilchqualität & des Prozesshygiene-Monitorings

Was macht die Forschungsanstalt ALP bzgl. VTEC? Sensibilisierung der Branche: Information an Verband der gewerblichen Käsereien über VTEC und vorbeugende Massnahmen gegen VTEC in der Käsefabrikation (E.Jakob):

Was macht die Forschungsanstalt ALP bzgl. VTEC? „Runden Tisch“ von Behörden & Praxis weiter pflegen Angebot VTEC-Analytik für Milchbranche: z.Zt. VTEC-Schnellmethode Duopath (Merck) Ziel: EU-Referenzmethode VTEC Durchführung Intensivmonitoring (E coli, VTEC, etc) Plan: Versuchskäse, Überleben von VTEC in Halbhartkäse Labor Spiez (Armee; Biohazard-Problematik) Vergleich VTEC-Isolate aus Käse & O157 Beratung betroffener Betriebe & Weiterbildung Regionalberater Modellrechnungen (risk assessment) Symposium „Mikr. Qualität von Rohmilchkäse“ (www.safeconsortium.org)

Zusammenfassung und Ausblick Definition humanpathogener VTEC ist schwierig Die Mehrzahl der Lebensmittel-Isolate gehören nicht zu den klassischen EHEC (Seropathotypen A & B), sondern zu den Seropathotypen C – E (nicht-humanpathogen über leichtem Durchfall bis HC/HUS) Einfluss auf verwendete Methoden, Resultat-Interpretation und und lebensmittelrechtliche Beurteilung (bleibt schwierig) mehr Forschung ist notwendig, um Pathogenitätsdifferenzen v.a. der Seropathotypen C-E zu erklären (Marker, Säureresistenz, etc) Konzept der Seropathotypen von EFSA (2007) prinzipiell anerkannt und Basis für kommende EU-Referenzmethode für VTEC Einheitlicher lebensmittelrechtlicher Vollzug auf Basis der kommenden CEN-Norm und eines noch zu definierenden mikrobiol. Kriteriums „VTEC“ wäre grundsätzlich möglich und ist erstrebenswert

Zusammenfassung und Ausblick Rohmilchkäse kann zu VTEC-Erkrankungen führen Der epidemiologische Impact dieser Kategorie spielt im Ggs. zu anderen Lebensmitteln (Rohmilch; Fleischprodukte) und anderen Übertragungsvehikeln eine begrenzte Rolle (bes. für die HUS-anfälligen Kleinkinder) Milchlieferanten und Käseproduzenten müssen dennoch VTEC sehr ernst nehmen und sich kontinuierlich um eine hohe Qualität der Rohmilch und der Produktionsabläufe bemühen Die Forschungsanstalt ALP leistet ihre Beiträge dazu

Zum Schluss ein persönliches Statement und