Überexpression von Proteinen und Affinitätschromatographie Blockpraktikum Molekularbiologische Arbeitstechniken WS 2004/2005 Bianca Löhr

Übersicht Einführung Probleme und Lösungsmöglichkeiten Möglichkeiten der Überexpression Expressionssysteme in E.coli Affinitätschromatographie

Einführung In der Molekularbiologie werden oft größere Mengen an nativem Protein benötigt Analyse der Funktion, Struktur etc. Überexpression bedeutet erhöhte Expressions- bzw. Transkriptionsrate eines Gens Auch verwendet für: vermehrte Bildung eines bestimmten Proteins über die natürliche Konzentration hinaus

Einführung Homologe Genexpression  Expression im endogenen Wirt Heterologe Genexpression  Expression in fremden Wirtssystemen

Einführung Natürlich auftretende Überexpression als Antwort auf unterschiedliche Milieubedingungen Nahrung, Temperatur etc. Immer induzierbare Expressionssysteme Künstliche Überexpression Nutzung von regulierbaren Promotoren aber auch von konstitutiven Systemen Es existieren viele Expressionssysteme für z.B. Bakterien, Pilze, Hefen, Höhere Pflanzen und Tiere

Probleme und Lösungsmöglichkeiten Bei der Überexpression können Probleme auftreten die durch das jeweilige Protein bedingt sind Proteine wirken teilweise toxisch Proteine werden abgebaut  Proteolyse Es treten niedrige Expressionsraten, Lyse und Absterben der Zellen auf Verminderung dieser Auswirkungen durch: Niedrige Kultivierungstemperaturen, kurze Induktionszeiten Einsatz proteasedefizienter Wirtsstämme Veränderungen des N-Terminus

Probleme und Lösungsmöglichkeiten Codonverteilung: Die Codonverteilung in unterschiedlichen Organismen ist verschieden Die Bevorzugung best. Triplettkombinationen führt zu unterschiedlichen Konzentrationen der zugehörigen tRNAs Die Translation eines fremden Gens mit anderen Codons ist erschwert Anpassung der Codons an die des Wirtes durch Mutagenese Co-Überexpression bestimmter tRNAs

Probleme und Lösungsmöglichkeiten Posttranslationale Modifizierung eykaryontischer Proteine  Glycosilierung, Phosphorylierung, etc. Modifizierung ist im Wirtssystem verändert oder fehlt Nutzung von möglichst nah verwandten Expressionssystemen

Probleme und Lösungsmöglichkeiten Bildung von Disulfidbrücken Bei Prokaryonten extracellulär bzw. im Periplasma Bei Eukaryonten im ER, nicht im reduzierenden Cytoplasma Eukaryontische Gene aggregieren bei cytosolischer Expression Transport in ein oxidierendes Zellkompartiment muss gewährleistet sein

Probleme und Lösungsmöglichkeiten Aggregation und Bildung von Inclusion Bodies bei Überexpression von hydrophoben Proteinen Proteine liegen nicht mehr in nativer Form vor Verminderung durch:  Limitierte Induktion, niedrige Temperatur, Gabe von nicht-metabolisierbaren Glucose-Homologon, Fusionsprotein, Überexpression von Hitzeschock-Proteinen

Möglichkeiten der Überexpression Überexpression als Inclusion-Body-Protein Nur bei guter Renaturierung des Proteins Vorteile: hohe Konzentrationen möglich (bis 50% des Gesamtzellproteins) und einfache Aufreinigung

Möglichkeiten der Überexpression Überexpression als Fusionsprotein Fusion mit Proteinen bzw. Proteindomänen Fusion mit kurzen, endständigen Peptiden: tags Vorteile: Verringerung von Toxizität, Proteolyse, Aggregation, Effiziente Aufreinigung mit Affinitätschromatographie

Möglichkeiten der Überexpression Häufig verwendete Fusionspartner-Proteine und Tags

Möglichkeiten der Überexpression Reinigungsschema für GST-Fusion

Möglichkeiten der Überexpression Spaltung der Fusionspartner Chemisch: Hydrolyse der Peptidbindung Enzymatisch: z.B. durch den Xa-Faktor

Expressionssysteme in E.coli Eine hohe konstitutive Expression beeinträchtigt meist den Zellmetabolismus Daher Anwendung von induzierbaren Expressionssystemen Promotor-Operator-System Induktion durch Metabolitzugabe, Entfernen best. Kohlenstoffquellen, Temperaturveränderungen

Expressionssysteme in E.coli Häufig genutzte Promotoren in E.coli

Affinitätschromatographie Prinzip: Spezifische und reversible Adsorption eines Moleküls an einen individuellen, matrixgebundenen Bindungspartner Selektive Adsorption aus einer komplexen Mischung

Affinitätschromatographie Schema Affinitätschromatographie

Affinitätschromatographie Durchführung: Adsorption der Probe: Bindungskonstante des Proteins  von 10-5 bis 10-7 M Waschen: Entfernung unspezifisch gebundener Komponenten durch erhöhte Ionenstärke Desorption: spezifisch oder unspezifisch Regeneration der Matrix: richtet sich nach der Verunreinigung der Ausgangsprobe

Affinitätschromatographie Schema Matrix

Affinitätschromatographie IMAC = immobilisierte Metallchelat-Affinitätschromatographie Basiert nicht auf biospezifischen Erkennungsmechanismen

Affinitätschromatographie Prinzip: Metall-chelatierte Gruppe ( bei uns NTA) ist am Säulenmaterial immobilisiert Ein multivalentes Übergangsmetall-Ion (bei uns Nickel) bindet an das NTA Interaktion mit den Histidinresten des His-tags Desorption durch Gradientenelution mittels Imidiazol  kompetetive Verdrängung

Affinitätschromatographie Bindung von zwei Histidinresten an die Ni-NTA-Gruppe