Biochemisches Praktikum für Biologen Institut für Biochemie Peter Friedhoff

Organisationsstufen in der Zelle

Bestandteile einer E. coli Zelle

Bestandteile einer E. coli Zelle

Proteinaufreinigung Funktion bekannt – Protein unbekannt Welches Protein ist für eine bestimmte Funktion verantwortlich? Protein bekannt – Funktion unbekannt Welche Funktion hat ein bestimmtes Protein?

Aufreinigung von Proteinen Proteineigenschaften Stabilität Löslichkeit Ladung Hydrophobizität Größe/Form/Masse spezifische Interaktionen (Affinität) Verfahren Zellaufschluß Pufferbedingungen Zentrifugation Fällung Dialyse Säulenchromatographie

Charakterisierung von Proteinen Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität) Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse) Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur) Massenspektrometrie (Masse/Sequenz) Edman-Sequenzierung (Sequenz) Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)

Aufreinigungsprotokoll von Proteinen

Aufreinigung von Rattenleber Glucokinase Page 142 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Voet Biochemistry 3e

Zentrifugation

Dialyse Dialysemembran lässt nur kleine Moleküle hindurch (z.B. Mr < 5000) Makromoleküle werden zurückgehalten Anwendung: Pufferwechsel

Säulenchromatographie Substanzen gelöste in mobiler Phase durchlaufen eine stationäre Phase. Wechselwirkung (Verteilung oder Adsorption) mit der Matrix bestimmen die Wanderungsge-schwindigkeit der gelösten Teilchen.

Ionenaustauschchromatographie Kationenaustausch- stationäre Phase Anion z.B. MonoS (-CH2SO3-) oder CM-Cellulose (-COO-) mobile Phase Kation Anionenaustausch- stationäre Phase Kation z.B. MonoQ (-CH2N+(CH3)3) oder DEAE-Sepharose (-CH2N+H(CH3)2) mobile Phase Anion

Gelfiltration oder Größenauschlußchromatographie

Affinitätschromatographie Protein (mobile Phase) bindet mit hoher Affinität und Selektivität an immobilisierten Liganden (stationäre Phase) Elution erfolgt z.B. mit freiem Liganden (Kompetition)

Affinitätschromatographie Affinitäts-tag Matrix Antigen Antikörper (immobiliert) 6His (His6-tag) Ni-NTA Strep-tag II (Peptid) Streptactin (Streptavidin-Derivat) Glutathion-S-Transferase Glutathion-Sepharose Calmodulin-Bindungs-Peptid Calmodulin-Affinitätsmatrix Maltose-Bindungs-Protein Amylose-Matrix

Glucose-Bindungsprotein Glucose-Bindungsprotein bindet an immobilisierte Glucose Elution durch (freie) Glucose, die Glucose-Bindungsprotein von der Matrix ablöst (kompetitive Elution)

Ni-NTA-Affinitätschromatographie Protein mit Histin-Affinitätstag bindet an immobilisierte Ni2+-Ionen Elution erfolgt durch Imidazol das mit dem Protein um die Bindung an Ni2+-Ionen konkurriert. Komplex aus His und Ni2+-NTA

Charakterisierung von Proteinen Aktivitätsassay (z.B. enzymatische Aktivität) Elektrophorese (1-D/2-D) (IEP/Masse) Spektroskopische Methoden (Funktion/Struktur) Massenspektrometrie (Masse/Sequenz) Edman-Sequenzierung (Sequenz) Röntgenstrukturanalyse/NMR (Struktur)

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Schematische Darstellung einer Protein-Aufreinigung analysiert mit Hilfe der SDS-PAGE

Isoelektrische Fokussierung/ 2-D Gelelektrophorese

2-D Gelelektrophorese

Western-Blotting

Western-Blotting Page 148 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Voet Biochemistry 3e

ESI-MS Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie

MALDI-TOF MS Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight

Ionisierungsverfahren für Massenspektrometrie Page 172 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Voet Biochemistry 3e

Massenspektrometrie exakte Bestimmung von Peptid/Proteinmassen

Identifizierung von Proteinen mit Hilfe der Massenspektrometrie SDS-Gel oder 2D-Gel Bande/Spot ausschneiden Tryptischer Verdau der Proteine Bestimmung der Peptidmassen  Peptid-Fingerabdruck  Datenbanksuche nach Proteinen mit identischem Peptid-Fingerabdruck

Chemische Analyse von Proteinen

Protein-Sequenzierung Edman-Abbau

Affinitätschromatographie/ Elektrophorese Ziel des Versuchs Aufreinigung eines rekombinantes Proteins exprimiert in Escherichia coli über Affinitätschromatographie Verfolgung der Aufreinigung mittels Fluoreszenz Analyse der Aufreinigung mittels SDS-Gelelektrophorese Untersuchung zur Thermostabilität des Proteins aufgrund seiner Fluoreszenz im nativen Zustand

Grün-fluoreszierendes Protein (GFP) Die biolumineszierende Qualle Aequorea victoria produziert Licht, wenn Energie des Ca2+-aktivierten Photoproteins Aequorin auf das Grün-fluoreszierende Protein (GFP) übertragen wird

GFP-Chromophor Chromophor entsteht nach oxidativer Zyklisierung des Tripeptids Ser-Tyr-Gly Der GFP-Chromophor fluoresziert nur, wenn es im nativ gefalteten Protein vorliegt

In vivo Fluoreszenz mittels GFP Page 119 © 2004 John Wiley & Sons, Inc. Voet Biochemistry 3e