PROTEOMICS (2) Vortrag im Rahmen des Genomics/Datenbanken Seminars

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1 PROTEOMICS (2) Vortrag im Rahmen des Genomics/Datenbanken Seminars
Von: Tabea Mundinger Betreuer: Benedikt Brors

2 Gliederung Einleitung Pankreatitis, Pankreaskarzinom Durchführung
Analysemethoden 2D PAGE Massenspektrometrie und Identifikation Western Blot Immunohistochemie Ergebnisse Diskussion

3 Einleitung 2003 Sequenzierung des menschlichen Genoms Warum?
Differentielle Genexpression kann in verschiedenen Geweben verglichen werden (microarrays etc.) Liefert nicht immer eindeutige Ergebnisse Warum? Krankheiten beruhen oft auf Proteindefekten, nicht Genexpressionsdefekte  Proteomics als wichtige Methode in z.B. Krebsforschung

4 Einleitung Anwendung Proteomics in Krebsforschung:
Shen et. al., Cancer Research Dez. 2004: Vergleich der Proteinexpressionsprofile von normalem Gewebe, Gewebe befallen von Pankreatitis und Pankreaskarzinomgewebe 2D Polyacrylamide Gel Electrophoresis (2D PAGE) Matrix-Assisted laser desorption/ionization time of flight (MALDI-TOF)

5 Pankreas Wichtigste Verdauungsdrüse im Körper Exokriner Teil:
Verdauungssäfte Bicarbonat Carbohydrasen, Esterasen, Proteasen, Nukleasen Endokriner Teil: Hormone Insulin, Glucagon, Somatostatin, Pancreatic Polypetide (PP) Werden in den Langerhansschen Zellen hergestellt Kontrolieren hauptsächlich Glycogenolyse, Glycogenese, Glucoseoxidation

6 Pankreatitis Entzündnug der Bauchspeicheldrüse Selten, aber gefährlich
15% der Fälle enden tödlich Auslöser (unter Anderem): Stoffwechselstörungen, Alkoholismus, Gallensteine, Durchblutungsstörungen, Infektionen (Mumps, Coxsackie-Virus) Gefährlich weil freiwerdende Verdauungssäfte umliegende Gewebe beschädigen

7 Pankreasadenokarzinom
Entsteht meistens aus exokrinem Teil Selten (1-2% aller Krebsarten) ABER: viert-häufigste Krebstodesursache Späte Erkennung: Anfangs nur leichte Symptome Schwere Symptome (Oberbauchschmerzen, Gelbsucht) später  mehr als ½ der Fälle schon Metastasierung

8 Analysemethoden (1): 2D PAGE
Kombination aus Isoelektrischer Fokusierung (IEF) SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) 1. Dimension: IEF: Gelstreifen mit immobilisiertem pH Seperation nach Isoelektrischem Punkt 2. Dimension: SDS-Page Seperation nach Molekulargewicht

9 Analysemethoden (2): MALDI-TOF
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation Time of Flight Co-Kristallisation von Protein und Matrix Energetische Anregung durch Laserimpuls Explosionsartige Teilchenablösung (Matrix verhindert Fragmentierung der Proteine) Detektor: ToF Misst Flugzeit der Proteine  Massenbestimmung

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11 Analysemethoden (3): Western Blot
Elektrophorese Blotting Übertragung auf Nitrozellulose mittels Puffer Hybridisierung Markierung mit Antikörpern (radioaktives oder enzymatisches Label) Nachweis: Farbreaktion, Chemilumineszenz oder Autoradiographie

12 Analysemethoden (4): Immunohistochemie
Primärantikörperfärbung Gegen ein spezifisches (schon bekanntes) Protein Sekundärantikörperfärbung Gegen konstanten Teil des Primärantikörpers Label: enzymatisch, fluoreszierend Hier: biotinyliert Signal wird verstärkt  mehrere Antikörper können binden Nachweis

13 Durchführung Gewebeproben: 2D PAGE MALDI-TOF
6x Normale Pankreasproben 7x Pankreatitis 6x Pankreaskarzinom 2x normale Gewebeproben von Karzinompatienten 1x Karzinom- und normale Pankreasprobe vom gleichen Patient 2D PAGE MALDI-TOF Datenbanken Suche (MS-Fit 3.2.1) Verifikation Western Blot, Antikörperfärbung (ICH)

14 Ergebnisse (Beispiel: Galectin-1)
1. Experiment: alle Proben getestet 2. Experiment: 6/8 Normal 5/7 Pankreatitis 4/6 Krebs Gewebe 29 Proteine wurden identifiziert Antioxidanten, Chaperone (oder Chaperon-ähnliche Proteine), Calcium-abhängige Bindeproteine, Proteasen, Verdauungsenzyme, Signaltransduktionsproteine, ECM Proteine

15 Galectin-1 Schon durch mRNA Experimente mit Pankreas Karzinom in Verbindung gebracht Zell-Adhesion Reguliert Zellwachstum Inhibiert Apoptose

16 Ergebnis (Galectin-1) 2D PAGE MALDI-TOF
6x höhere Expression im Krebsgewebe

17 Validierung (Galectin-1)
Western Blot 4/6 Krebsgeweben 0/8 normalem Gewebe 0/7 Pankreatitis

18 Validierung (Galectin-1)
ICH 67% der Krebsgewebeproben (D) enthalten galectin-1 100% des Stromas (E) enthält galectin-1 Kein galectin-1 in normalem Gewebe (F)

19 Diskussion Bestätigung von früheren Ergebnissen Aber:
Mehr als 30 von 40 untersuchten Proteinen konnten durch neue Methoden erstmals mit Pankreaskarzinom in Verbindung gebracht werden

20 Vielen Dank!!! Quellen: Shen et al., Protein Expression Profiles in Pancreatic Adenocarcinoma Compared with Normal Pancreatic Tissue and Tissue Affected by Pancreatitis as Detected by Two-Dimensional Gel Electrophoresis and Mass Spectrometry, CANCER RESEARCH 64, 9018–9026, December 2004 Iacobuzio-Donahue et al. Highly expressed genes in pancreatic ductal adenocarcinomas: a comprehensive characterization and comparison of the transcription profiles obtained from three major technologies. Cancer Res 2003;63:8614 –22 Person et al. Comparative identification of prostanoid inducible proteins by LC-ESI-MS/MS and MALDI-TOF mass spectrometry. Chem Res Toxicol 2003;16:757–7