Fluoreszenzpolarisation Vortrag im Modul biophysikalische Methode Kathrin Helwig und Franziska Schramm

Gliederung Einführung Aufbau Grundlagen Vorgehensweise der Messung Fluorophore Vor- und Nachteile Anwendungsbeispiele Literatur

Einführung weitverbreitete Messtechnik in der biophysikalischen Chemie 1926 entwickelt Analyse von molekularen Bindungen

Einführung Beobachtung der molekularen Bewegung fluoreszierender Moleküle in Lösung direkte, nahezu momentane Messung Heutige Anwendung für die Wechselwirkungsstudien bspw.DNA-DNA-, DNA-Protein-, Protein-Protein-Bindungen

Aufbau

Grundlagen

Grundlagen

Grundlagen

Vorgehensweise der Messung Messung der Polarisation einer Lösung fluoreszenz-markierter Liganden  FP1 Zugabe einer Probelösung mit bestimmter Konzentration in kleinen Voluminas, Inkubation  FP2 ΔFP = FP2- FP1  Änderung des molekularen Volumens

Vorgehensweise der Messung Wiederholung für verschiedene Konzentrationen der Probelösung Graphische Darstellung der Probenkonzentration-ΔFP-Beziehung Temperatur konstant halten Gesamtzeit der Messung: ~ 5 min

Fluorophore BODIPY (Borandipyrromethandifluorid) Fluorescein Rhodamin 6G

Vor- und Nachteile homogene Technologie Reaktionen sind sehr schnell (Sekundenbereich) zur GGW-Einstellung Reagenzien sind stabil große Ansätze können gemacht werden

Vor- und Nachteile hohe Reproduzierbarkeit keine Abtrennungsschritte hoch automatisierte Technik keine Waschschritte  steigert Genauigkeit  schnellere Messung  weniger Abfall Limitiert auf kleine Molekulargewichte

Anwendung DNA-DNA-WW Information über DNA-Proben nach Hybridisierung Oligothyminderivate mit EDA oder HMDA und FITC verwendet

Anwendung

Anwendungen FPIA: Fluoreszenzpolarisations-Immunoassays Polarisationsmessungen markierter Antigene Polarisation einer Mischung: aus Polarisation freier und gebundener Antigene und deren relative Fluoreszenzintensität

Anwendungen Bsp.: Antigen= Hormon Cortisol, Fluophor = Fluorescein Mischung aus fluoreszenzmarkierten Cortisol und spezif. Antikörper  Zugabe von reinem Cortisol  Verdrängung des markierten Antigens  Messung der Polarisation  Bestimmung der Cortisolkonzentration, die von den Antikörper gebunden wurden und der Antikörperkonzentration

Anwendung Enzyme Activity Imaging

Literatur K.Kakehi et al.,Fluorescence polarization: Analysis of Carbohydrate-Protein-Interaction, Analyt.Biochem., 2001, 297, 111-116 W.J.Checovich et al., Fluorescence poalrization-a new tool for cell and molecular biology, nature, 1995, 375, 254-256 Xiangning Chen et al.: Fluorescence Polarization in Homogeneous Nucleic Acid Analysis, Genome Res. 1999, 9, 492-498 www.biotek.de www.jolley.com www.iss.com http://probes.invitrogen.com/handbook/boxes/1572.html Murakami et al., Fluorescent-labeled oligonucleotide probes: detection of hybrid formation in solution by fluorescence polarization spectroscopy, Nucleic Acids Research, 1991, 19 (15), 4097-4102 W. Schmidt, Optische Spektroskopie, 2000, 2.Auflage, Wiley-VCH, S. 212 ff

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