Wenn Synapsen sauer werden - Einflüsse des intrazellulären pH und CO2 auf Neurotransmission

DAAD – RISE Weltweit Vollstipendium, Forschungspraktika bis 12 Wochen Nach dem Physikum, Abschluss Teil 1. Staatsexamen Datenbank weltweiter Projekte University of Kentucky – Cooper Lab Momentan an der UK: Felicitas Koch (VMF Leipzig) Alumni Treffen Münster Kontakt: sandra.bluemich@gmail.com Rise Zeichen FOTO

Gliederung Modellorganismen Physiologischer Hintergrund Versuchsdurchführung Ergebnisse Flusskrebs Drosophila Zusammenfassung Ergebnisse zu den beiden Modellorganismen (wegnehmen und nur sagen?)

Modellorganismen Glutaminerge Synapsen; ionotroper Glutamatrezeptor (NMDA) (pH sensitiv, durch Protonierung) Lange Geschichte, viel erforscht Verhalten und Dissektion Intervertebraten: Diskussion um Vertrebraten, auch Fadenwürmer, Zebrafische genutzt (Embryologie, Regenerationspotentiale), viele Knock outs in Drosophila, hochkonservierte Gene www.seagrant.umn.edu/ais/img/rustycrayfish/rusty_crayfish_01_high.jpg upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/d/dc/Drosophila_repleta_lateral.jpg

Flusskrebse

Drosophila Intrazelluläre Potentiale, Imaging gesamter fiber da sehr dünn Minis Dorsale und ventrale Sektion, je nachdem ob Herz oder Muskelpräparation Herz: ventral Muskel: dorsal

Veränderung des pH-Werts: Acidose Respiratorische Acidose Metabolische Acidose Hypoxie Ischämie CO2

Hintergrund http://www.biologie-schule.de/img/synapse1.gif

Elektrophysiologie 1) Ruhemembranpotential 2) Spontaneous Quantal Events (Minis) 3) EPSP: exzitatorische postsynaptische Potentiale

Ruhemembranpotential http://www.gesundheit.de/sites/default/files/images/roche/pics/a33790.000-1_big.gif

Depolarisation Jetzt: http://www.google.nl/imgres?imgurl=https://classconnection.s3.amazonaws.com/142/flashcards/262142/png/action_potential1334220921593.png&imgrefurl=https://www.studyblue.com/notes/note/n/neuro-327-chap-2/deck/5335910&h=600&w=799&tbnid=WGtJI6TW6YFdHM:&zoom=1&docid=qgTtDh0Bc08oRM&ei=hrFXVfH4LoGqsQHZ34HIAQ&tbm=isch&client=safari&ved=0CEcQMygdMB0 http://images.tutorvista.com/content/nervous-coordination/axon-membrane-stages.jpeg http://bioserv.fiu.edu/~walterm/Fund_Sp2004/musc_skel/Export%20Folder/f7-4_ion_channels_and_t_c.jpg

Spontaneous Quantal Events Spontanes Freisetzen Neurotransmitter ohne Stimulation nur wenige Vesikel Abhängig von der intrazellulären Ca2+-Konzentration http://www.google.de/imgres?imgurl=http%3A%2F%2Fwww.nature.com%2Fnrn%2Fjournal%2Fv16%2Fn1%2Fimages%2Fnrn3875-f5.jpg&imgrefurl=http%3A%2F%2Fwww.nature.com%2Farticles%2Fnrn3875&h=624&w=946&tbnid=fbqoOibcVGqmNM%3A&zoom=1&docid=P5CAniBP0WRPJM&ei=rJdXVev3OIirsQGCoICwBA&tbm=isch&iact=rc&uact=3&dur=2447&page=1&start=0&ndsp=14&ved=0CDkQrQMwCA Minis: http://www.nature.com/nature/journal/v388/n6645/images/388874ab.tif.2.gif

EPSP Exzitatorisches postsynaptisches Potential Nach Stimulation des Nerven messbar Stärkere Depolarisation als Minis

Versuchsdurchführung Klassischer Aufbau Intrazelluläre Elektrode, aber noch außen Elektrode, um Potentialunterschied zu messen http://www.bio.miami.edu/tom/courses/protected/ECK/CH06/figure-06-15a.jpg

Hintergrund pH Ammoniumchlorid (NH4Cl) Propionsäure (C3H6O2) NH3 + H+ CA HCO3- + H+ NH4+ CO2 H+

Ergebnisse www.domendos.com/uploads/pics/Projektreview_03.jpg

Flusskrebs – Neuromuskuläre Endplatte basisch sauer NH4Cl (60mMol) added, goes into neuron, Na/H+ Antiporter begins to work, wash out, acidic intracellular Increase in amplitude after acidification Low Na due to exchange NH4Cl (to keep osmolarity) Bei basisch EPSP noch gering, wenn sauer geht stark hoch, beruhigt sich dann aber auch wieder RP: normal, bei Alkalisierung Depolarisation, bei Acidifizierung Repolarisation

Flusskrebs – Neuromuskuläre Endplatte basisch sauer After washout quick recovery in EPSP (after few minutes (3-4‘)) Slow recovery concerning the pH (30‘) In Salzlösung als Referenz, dann mit CO2 deutliche Abnahme (s. auch Folie 12, „Nulllinie“), kann ausgewaschen werden Zweite Graphik mit pH Imaging (an Wright State University, OH): Grün für normalen pH, zu Beginn in Salzlösung normal, dann mit CO2 gering, kann ausgewaschen werden Allerdings Höhe der Amplitude schnell wieder regenerierbar durch CO2 Auswaschung, aber pH nur langsam auf ursprüngliches Niveau

Flusskrebs – Neuromuskuläre Endplatte CO2 NH4Cl 60mmol/l NH4Cl + Measurement EPSP after stimulation Saline normal, as reference With CO2 no response; CO2 and glutamate no response also (no depolarization even if transmitter added!) Recovery after washout Depolarization with low pH (but not with CO2); but no response with glutamate Mit Glutamat Desensibilisierung, erst EPSP (starke Depolarisation), dann nicht mehr, auch mit saurem pH Wenn CO2 dazu, dann gar nichts Sieht hier leider etwas verzerrt aus, weil gar keine Antwort…. But add glutamate in saline ...rapid depolarization then back to resting membrane potential due to the glutamate receptors desensitizing and not being open while being desensitized. However with CO2 and glutamate ...no depolarization... Maybe that is why EPSPs not observed...

Drosophila – Neuromuskuläre Endplatte basisch sauer Same as Crayfish: when basic then depolarization, when acidic lowering RP Decrease in apmplitude of EPSP upon alkalization Jumps up when acidification occurs, but then decreases Hier genau gleich, wie eben am Flusskrebs erklärt: Bei Alkalisierung RP depolarisiert, dann bei Ansäuerung wieder Repolarisation, nicht auf ursprünglichen Wert Dann bei EPSP Amplitude: hier geringer bei Alkalisierung (nicht so Flusskrebs), aber bei Ansäuerung gleiches Bild: erhöhte Amplitude pH Messung wie Flusskrebs; erholt sich nur langsam

Drosophila – Neuromuskuläre Endplatte RP angeschaut Low RP with pH 7.2 (physiological) When pH reduced to 5.0 slight depolarization, when glutamate added strong depolarization (physiological, that‘s the way it should work) Again back to low RP upon recovery When CO2 added slight depolarization, but clearly not as strong; when glutamate added no depolarization  somehow blocks the glutamate receptors Same thing shown in second graph (might leave it out, only have half an hour to present) Also was hier interessant ist: CO2 mit anderer Wirkung auf RP als pH; wenn präsynaptisch, dann dürfte die Sache mit dem Glutamat bei beiden nicht funktionieren, also muss postsynaptisch arbeiten

Drosophila – Neuromuskuläre Endplatte Co2 / NH4Cl pH 7.2 basisch sauer pH 7.2 No EPSP after exposure to CO2, but recovery possible If pH lowered EPSP decreased, but still there; recovery possible

Propionsäure Drosophila saline Propionsäure Saline PA (amplitude scale a little different, but basically same) Cd2+ PA + Cd2+ Unten: immer 1 Sekunde zwischen Strichen Noch keine statistische Auswertung erfolgt, noch nicht publiziert; dann abgereist; nicht viel daran gearbeitet in letzter Zeit – Felicitas Koch kann nächstes Jahr mehr berichten Propionsäure + Cadmium Cadmium

Drosophila: Minis No stimulation just spontaneous minis (fly muscle)... saline, add Cd2+ (blocks all volt gated channels on surface of pre synaptic  terminal) add P Acid with Cd2+ increase in minis... THUS Ca2+ not coming from Voltage gated Ca channels in plasma membrane... it is being dumped from ER within the Presynaptic terminal.

Zusammenfassung CO2 hat nicht nur einen ansäuernden Effekt Verschiedene Wirkungsmechanismen von CO2 und pH Blockieren der Neurotransmission durch CO2 Direkte Wirkung CO2 auf postsynaptische Zelle Depolarisation RP durch Ansäuern Erhöhung EPSP durch Ansäuern (Flusskrebs) Propionsäure erhöht Erregbarkeit Freisetzung Ca2+ aus Intrazellularraum??

Danke Dr. Robin Cooper C. Malloy Z. R. Majeed Prof. Einspanier Prof. Gäbel NWG erwähnen Anderes Wort für Danke?

Quellen Synaptic transmission: Effects of intracellular and intravacuolar pH R.L. COOPER1, Z. R. MAJEED1,2, C. MALLOY1, S.L.E. Blümich3 and R.W. PUTNAM4; 1Dept. of Biology, Univ of Kentucky, Lexington, KY. 40506, USA.; 2Dept of Biology, College of Sci, Univ. of Salahaddin, Erbil, Iraq; 3VMF, Univ. Leipzig, Germany; 4Dept. of Physiology & Biophysics, Wright State University, Dayton, OH. The Cooper Lab, Department of Biology, University of Kentucky Lexington, KY – 40506 USA

Danke für Ihre Aufmerksamkeit http://ub.meduniwien.ac.at/blog/wp-content/uploads/2007/10/nervenzelle.jpg