Elektrophorese, Immunodetektion BIOCHEMIE Elektrophorese, Immunodetektion

Regulation von Enzymaktivitäten - Ebene 1 - Enzyme können auf folgenden Ebenen reguliert werden Regulation der bestehenden Enzymmenge Post-translational durch reversible, kovalente Modifikation (Phosphorylierung, Reduktion) pH-Wert, (Co-)Substratkonzentration Effektoren Enzym-Inhibitorprotein-Interaktionen (14-3-3 Proteine) Enzymreinigung Chromatographie

Regulation von Enzymaktivitäten - Ebene 2 - Regulation der Enzymproteinmenge Genexpression Transkription (Induktion/Repression) Splicing, mRNA Stabilität Translation Proteolytischer Abbau Enzymproteingehaltsbestimmung Elektrophorese, Blotting

Elektrophorese Prinzip „Wanderung eines geladenen Teilchens im elektrischen Feld“ Proteine, DNA, RNA, organische Säuren, Kationen etc. Aminosäuren sind amphotere/zwitterionische Verbindungen

Elektrophoretische Trennung von Proteinen Proteine weisen positive und negative Ladungen auf ihrer Oberfläche auf.

Matrices bzw. Gele Polyacrylamidgele Stabilisierung der wandernden Proteinbanden in Gelen

Matrices bzw. Gele Polyacrylamidgele Die Monomerkonzentrationen bestimmen die Porengrössen der Polyacrylamidgele T [%] = (a + b) * 100 / V C [%] = b * 100 / (a + b) a....Gewicht an Acrylamid b....Gewicht an Methylenbisacrylamid V....Volumen in mL

Zusammenhang zwischen Porengrösse und %T sowie %C Fall A C konstant T erhöht Porenweite sinkt Fall B T konstant C erhöht Peakverteilung Minimum bei 4% C, bei höheren und niedrigeren Konzentrationen nehmen die Porengrössen wieder zu

Geometrie der Gelelektrophorese Rundgele vs. Flachgele horizontal vs. vertikale Systeme

Elektrophorese-Apparaturen

Elektrophoretische Trennprinzipien Polyacrylamid-Gelelektrophorese 3 2 1

Bildung des pH-Gradienten Isoelektrische Fokussierung Bildung des pH-Gradienten Trägerampholyte sind Oligoamino-oligocarboxylsäuren Sie weisen ver-schiedene Isoelek-trische Punkte auf

Elektrophoretische Mobilität v Trennung von Proteinen erfolgt aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität v = E . z / (6p h r) E...elektr. Feld h...Viskosität Nettooberflächenladung z pH-abhängig Molekülgrösse, -form r Stoke`scher Radius + - Anode Kathode

Kombination aus Isotachophorese und Zonenelektrophorese diskontinuierliche PAGE Kombination aus Isotachophorese und Zonenelektrophorese

native PAGE Proteintrennung auf Basis Oberflächenladung und Grösse keine Proteindenaturierung Proteintrennung auf Basis Oberflächenladung und Grösse d.h. Proteine verschiedener Molekülgrösse können in der nativen PAGE gleich schnell wandern kann auch zur Reinigung nativer Proteine eingesetzt werden optimierbar über Pufferzusam- mensetzung, pH-Wert und Porengrössen

Sodium dodecylsulphate SDS-PAGE Sodium dodecylsulphate SDS ist ein anionisches Detergens, das in stöchiometrischem Verhältnis von 1.4 g SDS je an 1 g Protein bindet Hierbei wird die native Konfiguration in eine ellipsoide K. aufgefaltet

SDS-PAGE Vorteile die Oberflächenladungen der Proteine werden maskiert die Menge der „neuen“ negativen Ladungen korrelieren mit der Masse des Proteins (in Dalton) alle Proteine besitzen nach der Auffaltung diesselbe Konfiguration die Trennung erfolgt folglich nach Molekularmasse der Proteine Ausnahmen: Glykoproteine, Peptide < 15kDa

Auswertung des Molekulargewichts Kalibration Relative Mobilität gegen log Molekularmasse ergibt lineare Beziehung Kalibration mit Polypeptiden bekannter Molekularmasse

SDS-PAGE Beispiel Gradientengel Coomassiefärbung Porengrössenverteilung im Gel kontinuierlich ansteigend gewährleistet hohe Trennleistung und Schärfe über weiten Molekularmassenbereich von Proteinen

unspezifische Färbungen Visualisierung unspezifische Färbungen Allgemein erfolgt nach der PAGE eine Fixierung der Polypeptidbanden mit Alkoholen/Säuren oder durch Blotting Färbung Coomassieblau-Färbung (> 1 ng pro Proteinbande) siehe auch Bradford-Assay Silber-Färbung (20-200x sensitiver) # Verstärkung der Ag+-Bindung (Glutaraldehyd) # Ag+-Imprägnierung # Waschung # Entwicklung: Ag+-Reduktion zu Ag am Protein

unspezifische Färbungen Visualisierung der Polypeptidbanden unspezifische Färbungen

Visualisierung weitere Varianten Enzymaktivitätsfärbungen nur bei nativer PAGE künstliche Substrate / Cofaktoren Bildung eines unlöslichen Produktes in der Enzymreaktion Autoradiographie von markierten Proteinen

Western-Blotting Prinzip Immobilisierung von Proteinbanden durch Transfer aus dem Gel auf proteinbindende Membranen Transfer wird meist elektrophoretisch durchgeführt (Elektroblotting) Typische Membranen bestehen aus Nitrocellulose, Nylon oder PVDF (Polyvinylidendifluorid) spezifische Polypeptiddetektion auf der Membran meist per Immunodetektion, die in PAGelen nicht möglich wäre (MG)

Western Blotting Durchführung

Antigen-Antikörper-Reaktion Antikörper -Aufbau -Konfigu- ration Paratope

Antigen-Antikörper-Reaktion Antigen-Determinanten Epitope

Immunodetektion Ablauf Nachweisreaktion SekundärerAntikörper Primärer Antikörper

Immunodetektion Nachweisreaktion

Ausblick