Plasmidisolierung, Restriktions-analyse und Gelelektrophorese Katja Behling

Plasmide sind kleine, ringförmige DNA-Moleküle, die sich auf Grund eines eigenen Replikationsursprungs autonom vermehren können Vorkommen: in Bakterien und niedrigen Eukaryonten (T7) Promotor MCS (multiple cloning site) Ampicillin Resistenz origin Plasmid Gen Aufbau eines VEKTORS

Funktion von Plasmiden unter den normalen Wachstumsbedingungen entbehrlich R-Plasmide: Selektionsvorteil (Resistenzen) F-Plasmide: Konjugation zwischen zwei Bakterienzellen als Vektoren: wichtiges Werkzeug für die Molekularbiologie zur Vervielfältigung oder Expression von Genen

Plasmidisolierung Methode 1: Aufschluss durch alkalische Lyse pelletierte E.coli-Zellen Resuspendierung der Zellen in einem EDTA-haltigem Puffer alkalische Lyse mittels SDS und NaOH SDS löst als Detergenz die Phospholipide und Proteinkomponenten, NaOH denaturiert chromosomale DNA, Plasmid-DNA und Proteine Neutralisation durch KAc-Puffer Zelltrümmer, denaturierte DNA präzipitieren durch Zentrifugation Aufreinigung des Plasmids aus dem plasmidhaltigen Überstand mittels einer Säule (Glasfasersäule)

Plasmidisolierung Methode 2: Aufschluss durch Lysozym (1) pelletierte E.coli-Zellen: Homogenisierung in STETL-Puffer S: Sucrose – osmolytische Aufbruch der Zellmembran, nach Lysozymbehandlung T: Triton X-100 - Auflösung der Zellmembran E: EDTA – Komplexierung von Mg2+ und Ca2+, die zum einen die Zellwand stabilisieren und zum anderen für die Enzymaktivität nötig sind T: Tris/HCl (pH 8) – Pufferung L: Lysozym – Spaltung des Murein

Plasmidisolierung Methode 2: Aufschluss durch Lysozym (2) Zentrifugation Abtrennung der Zelltrümmer Fällung mit Isopropanol Pelletierung von DNA und Proteinen Phenol-Chloroform-Extraktion Trennung von DNA und Proteinen Fällung der DNA mit Ammoniumacetat und Ethanol (NH4+ CH3COO-) verhindert die Co-präzipitation von freien Nukleotiden

Restriktion von DNA Restriktion ist das Schneiden von DNA-Molekülen mit Enzymen DNasen Deoxyribonukleasen Endonukleasen Abbau von „Innen“ Exonukleasen Abbau von den Enden z. B. DNase I, II, Nuklease S1 z. B. Exonuklease I-VI, Lambda-Exonukl., T7 Exonuklease

Nomenklatur von Restriktionsenzymen Nomenklatur (Smith & Nathans, 1973) Name des Enzyms ist eine Abkürzung - Ableitung vom Wirtsorganismus - drei Buchstaben kursiv Bsp.: Escherichia coli = Eco 2. Anzahl von Restriktions-und Modifikationssystemen, durch römische Zahl gekennzeichnet. - Bsp.: Hind I, Hind II, Hind III etc. (Haemophilus influenza, Serotyp: Rd) Bsp: Escherichia coli EcoRl

Erkennungssequenzen von Restriktionsenzymen Erkennung und Schneiden nach Tetra-. Penta-, Hexa-, oder Heptanukleotidsequenzen AATTC G 5`-GiAA TT C 3`-C TT AAhG G CTTAA Eco RI GiAA TT C C TT AAhG Palindrom „sticky ends“ (klebrige Enden) (kohäsive Enden) AATTC G 5`-GiAA TT C 3`-C TT AAhG G CTTAA Eco RI Sma I (Serratia marcescens) 5`-CCCi GGG 3`-GGGh CCC CCC GGG GGG CCC glatte Enden (stumpfe Enden)

Trennung von Stoffgemischen: Elektrophorese Wanderung elektrisch geladener Teilchen durch einen als Trägermaterial dienenden Stoff in einem elektrischen Feld als Trägermaterial dienen Gele (Polyacrylamid, Agarose) die elektrophoretische Bewegung hängt von folgenden Faktoren ab: Gesamtladung des Moleküls Größe und Gestalt des Moleküls Porengröße des Gels pH-Wert, Temperatur und Ionenstärke des Puffers angelegte Spannung

Gelelektrophorese von Nukleinsäuren zur Analytik und Reinigung von DNA oder RNA unter nativen Bedingungen: Agarose-Gele: Polymer aus D-Galactose und 3,6-Anhydro-L-Galactose Bildung eines komplexen Netzwerkes (molekulares Sieb)

Herstellung der Gellösung Agarose wird durch Aufkochen in Pufferlösung gelöst Zugabe von Ethidiumbromid Ausgießen der Lösung auf eine horizontale Apparatur, Kamm setzen bei Abkühlung erstarrt die Masse zu einem festen Gel

Agarosegelelektrophorese I

Agarosegelelektrophorese II

Ethidiumbromid (EtBr) interkaliert in die DNA Bestrahlung mit UV  orange Fluoreszenz

Gelelektrophorese von Plasmid-DNA

Klonierung

Praktikum Plasmid- isolierung Restriktionsverdau Gelektrophorese Methode 1 Methode 2 Restriktionsverdau Gelektrophorese