Genotypische und phänotypische Charakterisierung

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 Präsentation transkript:

Genotypische und phänotypische Charakterisierung Prof. Dr. F. Meinhardt B-Kurs Mikrobielle Molekularbiologie Institut für Mikrobiologie WWU Münster Induzierbare Enzyme: Genotypische und phänotypische Charakterisierung der bgaR-Disruptionsmutante Bacillus megaterium MS970 - Ergebnisse WS 02/03 -

1. und 2. Woche: genotypische Charakterisierung - Isolation chromosomaler DNA aus B. megaterium DSM319/MS970 - Restriktion mit HincII - Gelelektrophorese - Transfer auf Nylonmembran (Southern Blot) - Nachweis zweier Restriktionsfragmente mit bgaR-Anteilen

Genetische Organisation der bgaR-Disruptionsmutante MS970 im Vergleich zum Wildtyp DSM319 1.4 2.6 1.4 3.4

Der Stamm MS970 ist Glucanase-positiv, der Stamm DSM319 negativ

Gelelektrophoretische Überprüfung der isolierten chromosomalen DNA

HincII-Restriktion der chromosomalen DNA

Hybridisierung der chromosomalen DNA mit einem Digoxygenin-markierten EcoRI-Fragment aus pUCXL

Ergebnis des Southern-Blots

Quantifizierung der b-Galactosidase-Aktivität

Ergebnis des b-Galactosidase-Enzymtests

Der bgaM-Promotor ist von CREs (catabolite responsive elements) überlagert

Das bgaR-Genprodukt ist ein positiver Regulator der b-Galactosidase-Expression bei B. megaterium

Protokollgliederung 1. Zusammenfassung 2. Einleitung - Prinzip Gendisruption - bgaR / Disruptionsvektor pDXyl - Versuchsziel 3. Material und Methoden - Abweichungen vom Skript - Prinzip des Glucanase-Tests erläutern - Prinzip des Southern-Blot / DIG-System erläutern 4. Ergebnisse - Ergebnis des Glucanase-Tests - Ergebnis des Southern-Blot - Ergebnis des Enzymtests 5. Diskussion - Genotypische Charakterisierung erläutern - Welchen Rückschluß auf die Funktion von BgaR erlaubt der Enzymtest ? - Vergleich der Mechanismen zur Katabolitrepression / Substratinduktion bei E. coli / Bacillus, wo positive/negative Kontrolle ? 6. Literatur 7. Anhang - Pipettierschemata - Einzelwerte der photometrischen Messungen