Konzepte der Immunologie für Naturwissenschaftler (MOLIM-S1) SS 2007 Humorale Immunität (Antikörper – Methoden & Anwendungen) Prof. Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie an der Medizinischen Klinik III Nikolaus-Fiebiger-Zentrum Tel.: 09131-8535912 E-Mail: HJAECK@molmed.uni-erlangen.de

HUMORALE IMMUNITÄT Thema 2: SS 2005 Antikörper - Anwendungen Ak/Ag-Reaktionen Gewinnung spezifischer AK Anwendungen – Diagnostik & Forschung Anwendungen – Therapie Prof. Dr. Hans-Martin Jäck Abteilung für Molekulare Immunologie an der Medizinischen Klinik III

Antikörper sind bifunktional VH CH1 CH2 CH3 Variable Region der H- und L-Kette definiert die Spezifität Konstante Region der H-Kette bestimmt die biochemischen und biologischen Eigen- schaften (Effektorfunktion) VL CL

Antikörper – Antigenreaktionen Epitop – Bindungsstelle im Ag Paratop – Bindungsstelle im AK Hypervariable (HV) Regionen (oder CDRs) der H- und L-Kette bilden das Paratop HV3 (CDR3) HV1 (CDR1) HV2 (CDR2) Aus Janeway: Immunobiology

Wechselwirkungen Wasserstoffbindungen Elektrostatische Kräfte Brückenbildung zwischen Sauerstoff- oder Stickstoffatomen von Antigen und Antikörper     (Ag-O - H - O-Ak oder  Ag-N - H - N-Ak) Elektrostatische Kräfte entstehen, wenn sich positive und negative freie Ladungen auf Antigen und Antikörper gegenüber liegen Van der Waals-Kräfte resultieren aus der Interaktion zwischen Elektronenwolken (Dipole) Hydrophobe Wechselwirkungen basieren auf einer Verdrängung von Wasser- Molekülen durch apolare, hydrophobe Gruppen (aromatische Aminosäuren). Diese Bindungsart kann bis zu 50% der Bindungskräfte ausmachen.

Nieder- und hochaffine Antikörper Anziehungskräfte wirken nur über sehr kleine Distanzen Antigenbindungsstelle des Antikörpers Antigenbindungsstelle des Antikörpers Epitop des Antigens B Epitop des Antigens B kD = 10-8 Mol-1 kD = 10-5 Mol-1

Antigene – Definitionen und Struktur Antigen (Antikörper generierend) Jede Substanz, die an einen Antigenrezeptor bindet. Antigenrezeptoren sind Immunglobuline und T-Zellrezeptoren Immunogen Substanz, die nach Injektion oder Infektion eine Antikörperantwort auslöst Gut: Proteine und Kohlenhydrate Schwach: DNA, Lipide, kurze Polypeptide Negativ: Aminosäuren, Haptene Hapten (Halbantigen) Kleines chemisch synthetisiertes Molekül, das an Rezeptor bindet, alleine aber keine Immunantwort auslöst. Immunogen nach Kopplung an Trägerprotein Epitop bzw. immunogene Determinante Der Bereich eines Immunogens, der mit dem Antikörper interagiert (bei Proteinen: 6-8 Aminosäurereste) B-Zell-Epitope Konformations- epitop Lineares Epitop Neo- Epitop Aus: Kuby, Immunology

B-Zell-Antigene - Einteilung Nach Herkunft Natürlich (Proteine, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren, bakt. Toxine, Zellen) Synthetisch (Haptene, Polypeptide) Nach chemischen Gesichtspunkten Proteine Kohlenhydrate Nukleinsäuren Konjugierte Proteine (Hapten-Protein) Polypeptide Lipide Nach genetischer Beziehung zwischen Spender und Empfänger Autoantigen - aus dem zu immunisierenden Individuum Isoantigen - aus einem genetisch identischen (syngenen) Spender (Inzuchtmäuse) Alloantigen - aus einem nichtverwandeten Spender derselben Spezies (Bl6, Balb/c) Xenoantigen - aus einem Spender einer anderen Spezies

Vergleich von B-Zell- und T-Zellepitopen Ag MHC II MHC I Antigen- prozessierung und -präsentation TZR BZR Aus Janeway

Affinität und Avidität Maß für die Stärke der Wechselwirkung zwischen einer Ag-Bindungsstelle (Paratop) auf dem AK und einem Epitop auf dem Antigen Gute Affinität: ka = 10-8 - 10-10 M-1 Mittlere Affinität: ka = 10-5 - 10-7 M-1 AVIDITÄT Maß für die Stärke, mit der ein bivalenter Antikörper an ein intaktes polyvalentes Antigen (z.B. Bakterien und Viren) bindet Größer als Affinität http://www-immuno.path.cam.ac.uk/~immuno/part1/ lec06/lec6_97.html

Avidität (eine weitere Erklärung) “Natürliche Antigene, wie beispielsweise Viren oder Bakterien besitzen viele gleiche Antigen- Determinanten auf ihrer Oberfläche. Wenn ein multivalentes Antigen sich mit mehr als einer Fab-Region des Antikörpers verbindet, ist die entstehende Bindungsenergie beträchtlich grösser als die Summe der beteiligten Einzelbindungen, da sämtliche Ag-Ak Bindungen gleichzeitig aufgebrochen werden müssen, wenn Ag und Ak sich wieder trennen sollen. Falls eine Fab-Stelle loslässt, ist die Wahrscheinlichkeit, dass eine andere Fab-Region des Ak gerade gebunden ist, recht gross, was die Bindungsstärke mehr als nur verdoppelt. Die Kraft, die ein solcher multivalentes Ag mit einem multivalenten Ak bindet nennt man Avidität, sie ist, wie in der Abbildung dargestellt zwischen 103 und 107 mal stärker als die entsprechende Affinität. Unter physiologischen Bedingungen spielt die Avidität eine wichtigere Rolle, im Labor findet jedoch die Affinität häufiger Verwendung”. Quelle: leider verloren gegangen

Gewinnung spezifischer Antikörper Immunisierung von Labortieren mit Antigenen Polyklonale Antiseren Heterogenes Gemisch von Antikörper, die ver-schiedene Epitope auf dem Immunogen erkennen Immunisieren von Tieren mit Antigen in komplettem Freunds Adjuvans [besteht aus Mineralöl (→ Depot-wirkung) und abgetöteten Tuberkelbazil-len→(unspezifische Aktivierung von DZ u. MF)] Immunisierungen werden mehrmals wiederholt (Boosts) Monoklonale Antikörper homogener Antikörper, der nur ein Epitop auf dem Immunogen erkennt Immunisierung von Maus, Ratte, Hamster, Kaninchen oder (Mensch) Generierung von Hybridomen

Aminopterin blockiert De Novo Purin- und Pyrimidinsynthese Hybridomatechnik: Gewinnung monoklonaler Antikörper (Köhler und Milstein, 1976, Nobelpreis 1984) Aminopterin blockiert De Novo Purin- und Pyrimidinsynthese Milz-B Myelom HGPRT + Ig+ sterblich HGPRT - Ig- unsterblich PEG De Novo Nukleotide DNA, RNA Salvage Pathway Thymidin Thymidin- kinase (TK+) HAT-Medium: Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin Hypoxanthin Hypoxanthin- Guanin- Phospho- ribosyl- transferase (HGPRT+) B-Zell/Myelom-Hybrid Ig+ HGPRT + unsterblich Amin- opterin Aus Kuby

Gegen verschiedene Formen eines bestimmten AK (allo) Antikörper gegen Immunglobuline Durch Immunisieren z.B. eines Kaninchens mit gereinigtem Maus-IgM aus einer weißen Maus = BALB/c wird die Produktion folgender Kaninchen-Antikörper induziert. Anti-idiotypische AK (gegen Epitope in V-Regionen der H- und L-Kette) Gegen eine bestimmte (private= idio) Form eines AK BALB/c C57Bl/6 Die konstante Region der mH-Kette aus einer BALB/c-Maus (weiß) und einer C57Bl/6-Maus (schwarz) unterscheidet sich in einer Aminosäure  verschiedene Allotypen codiert durch Varianten desselben Gens bzw. Allels) BALB/c Anti-allotypische AK (gegen ein bestimmtes Epitop In C-Region) Gegen verschiedene Formen eines bestimmten AK (allo) Anti-isotypische AK (gegen Epitope in C-Regionen der H- und L-Kette) Gegen verschiedene AK-Klassen (iso)

Antikörperphagen B-Zellen aus immunisiertem oder nicht-immuninisiertem Aus Janeway: Immunobiology B-Zellen aus immunisiertem oder nicht-immuninisiertem Tier Klonierung in Phagenvektor Phagenantikörper- Bücherei Isolierung durch Panning Isolierung von VH und VL-DNA-Fragmenten aus B-Zellen mittels PCR Klonierung der VH- und VL-Fragmente in Bakteriophagen-Vektoren Transformation in E.coli Isolierung spezifischer Antikörperphagen mittels Affinitätschromatographie oder ‚Panning‘ an immobilisiertem Antigen

Antikörper und Antikörper (Ak)-Fragmente Bispezifischer IgG-Antikörper CH1 VH Papain- verdau Fab CL VL Natürlich vorkommender, monospezifischer IgG-Antikörper F(ab’)2 Pepsin- verdau Rekombinante Manipulation CH3 CH2 Fd (Fragment of Domains) Diabody scFv (Single-chain Fragment of Varibale regions) Rekombinant in E.coli, Hefe und Insekten- bzw. Säugetierzellen

Humanisierte Maus-Antikörper Murine VH-Region Sequenzen des Paratops (Hyper- varibale Region = CDR) im humanen Ak werden rekombinant durch entsprechende Sequenzen aus Maus-Ak ersetzt Muriner Ak Humaner Ak Chimärer Ak Humanisierter, chimärer Ak Chimäre - feuerspeiendes Ungeheuer aus der griechischen Mythologie mit dem Kopf eines Löwen, dem Körper einer Ziege und dem Schwanz eines Drachen.

Anwendungen von Antikörper in Forschung und klinischer Diagnose Nachweis und Quantifizieren löslicher Moleküle Nachweis intrazellulärer und membrangebundener Proteine auf Einzelzellniveau Nachweis und Quantifizierung von Zellpopulationen innerhalb einer Zellsuspension Nachweis sezernierender Zellen Anreicherung und Isolierung definierter Zellpopulationen Proteinreinigung und Untersuchung von Proteinkomplexen Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen

Nachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle In Lösung: Heidelberger Titrationskurve Menge der Ak-Ag-Komplexe Antigen-Konzentration Antikörper-Konzentration Aus Janeway: Immunobiology

Im Gel: Doppelimmundiffusion nach Ouchterlony Prinzip: Ag1 und Ag 3 haben keine gemeinsamen Epiotope, i.e., sie sind verschiedenen Ag1 und Ag 2 besitzen identische Epiotope Beispiel: Antigen und Antiserum werden in Ver- tiefungen in der Agarmatrix pipettiert Antikörper Antigen Agarmatrix Präzipitatslinie Anfärben Aus Janeway: Immunobiology

Radialer Immundiffusionstest (nach Mancini) Ak Ag Präzipitations- ring Durch- messer Ak Ag Quantitativer Nachweis von Antigenen (z.B. Serum IgG) Antikörper wird in Agar eingegossen Antigen wird in Vertiefung gegeben Diffusion des Antigens Äquivalenzpunkt => Präzipitation Durchmesser des Präzipitationsrings ~ Konzentration Mitführen eines Ag-Standard Bestimmung der Ag-Konzentration aus Eichkurve

Nachweis und Quantifizierung löslicher Moleküle ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) Qualitativer und quantitativer Nachweis löslicher Moleküle mit spez. AK direkt indirekt „capture“ Enzym Antigen H2O2 2 H2O

Übliche Enzyme + Alkalische Phosphatase (AP) OH + O P O N+ O N+ O P OH O- O- O- O- OH- gelb farblos Meerrettich-Peroxidase (Horseradish peroxidase = HRP) H H O N O N H H H2O2 2 H2O farblos Konjugiertes P-Elektronensystem ➙ farbig

Schwangerschaftsnachweis durch Agglutinationsinhibition HCG human chorionic gonadotropin Humanes Chorion-Gonadotropin Schwangerschaftshormon Wird zuerst von Blastozyste, dann von Plazenta gebildet Kann bereits 6-15 Tage nach der Befruchtung im Urin nachgewiesen werden Verantwortlich für morgentliches Erbrechen Kein HCG Im Urin  nicht schwanger HCG Im Urin  schwanger Aus Janeway

Blutgruppennachweis durch Hämagglutinationsreaktion Verklumpung korpuskulärer Bestandteile durch Anti-körper Aus Janeway

Nachweis von Antigenen in und auf Zellen Photoimmunfluoreszenz Durchflusszytometrie  Analyse eines Antigens auf Einzelzellbasis

Photoimmunfluoreszenz + AK Fluoro- chrom AK + irrelevanter AK Zelle Aus Janeway: Immunobiology (FITC)

Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellen z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz Granularität FITC-anti-CD4 PE-anti-CD8 Grün Zell- göße Rot Aus Janeway, Immunobiology (Düse) Granularität Photozellen Zellgöße

Durchflusszytometrie und FACS FACS steht für Fluorescence activated cell sorting und beschreibt ein Verfahren, das in der Biologie und in der Medizin zur Anwendung kommt. Der Ausdruck "FACS" ist eine geschützte Handelsmarke der Firma Becton Dickinson. Der Name ist eigentlich irreführend, da meist keine Sortierung vorgenommen wird, sondern nur eine Messung der Eigenschaften von Zellen Die allgemeine Bezeichnung des Verfahrens lautet Durchflusszytometrie. Das Prinzip der Untersuchung beruht auf der Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen Laserstrahlpassiert.

Durchflusszytometrische Analyse von Proteinen auf der Oberfäche von Zellen z.B.: Nachweis von CD8- und CD4-positiven T-Zellen in der Milz Zellzahl Histogramm Fluoreszenzintensität = FI () PE anti-CD4 FITC anti-CD8 FITC-anti-CD8 PE-anti-CD4 Grün Dotplots FI (FITC anti-CD8) FI (PE anti-CD4) Rot Aus Janeway, Immunobiology Granularität Zellgöße

Quantitativer Nachweis sezernierender Zellen Jerne-Plaque-Assay Durchflusszytometrie Elispot-Assay  Bestimmung der Frequenz sezernierender Zellen

Hemolytischer (Jerne) Plaque Assay (N. Jerne, A. Nordin & C. Henry) Bestimmung der Frequenz AK-sezernierender Plasmazellen in einer Milzzellkultur Plasmazelle SRBC:sheep red blood cells PFC: plaque-forming units Aus Kuby, 4th edition

Nachweis sezernierender Zellen mittels der Elispot-Technik Bestimmung der Frequenz Zytokin-sezernierender Milzzellen vor und nach Stimulierung + - Aus Janeway 4th edition Animation unter: http://www.elispot-analyzers.de/english/elispot-animation.html

Durchflusszytometrischer Nachweis sezernierender Zellen Beispiel: Nachweis Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (Assay nach Milteny Biotech) PE Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent beladen Zellen werden stimuliert  IFN-g wird sezerniert und von IFN-g-Catch abgefangen Gebundenes IFN-g wird mit Fluorochrom -konjugierten (PE) anti- IFN-g -Ak inkubiert Zellen können durchflusszytometrisch analysiert Alternativ können Zellen mit magne- tisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN-g sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden (PE anti-IFNγ)

Isolierung definierter Zellpopulationen Sortierung von Zellen anhand von Oberflächenproteinen Magnetische Methode (MACS) Durchflusszytometrsiche Methode (FACS) Aus Janeway: Immunobiology

Anreicherung sezernierter Zellen mittels der FACS- oder MACS-Technik Beispiel: Anreicherung Zytokin-produzierender T-Zellpopulationen (nach der FACS/MACS-Methode von Milteny Biotech) Zellen werden mit IFN-γ Catch-Reagent beladen Zellen werden stimuliert  IFN-g wird sezerniert und von IFN-g-Catch abgefangen Gebundenes IFN-g wird mit Fluorochrom -konjugierten (PE) anti- IFN-g -Ak inkubiert Zellen können durchflusszytometrisch analysiert und gleichzeitig durchflusszytometrisch sortiert werden Alternativ können Zellen mit magne- tisierbaren anti-PE-Ak behandelt und IFN-g sezernierende Zelle magnetisch ange-reichter werden Magnetisierbare anti-PE-AK

Proteinaufreinigung und Analyse von Proteinkomplexen Aufreinigung von Proteinen mittels Affinitätschromatographie Aus Janeway: Immunobiology

Immunpräzipitation metabolisch radioaktiv-markierter Polypeptide kD 200 97 66 45 31 St 1 2 m k Zellkultur-Überstand Zell-Lysat Autoradio- oder Fluorogramm Metabolische Markierung IgM-produzierende Zellen Anti-mH-Ak Aus Janeway: Immunobiology

Nachweis von Protein-Protein-Interaktionen mittels einer kombinierten Immunpräzipitations-/Westernblotanalyse Versuch: Untersuchung des Einflusses einer IgL-Kette auf die Interaktion einer IgH-Kette mit dem Chaperon BiP Membran IP: anti-IgH Zelllysate aus H+ und H+L+ Plasmalinie Elektrophorese SDS-Polyacyl- amidgel Elektro- transfer mHL mH IgH Zelllinie Enzym-konjugierte Sekundär-antikörper anti- IgH (1) BiP anti- BiP (2)

Anwendungen von AK in der Therapie Immundefizienz Entzündung Autoimmunität Infektion Krebs

Modifizierte Antikörper als Virus- bzw- Tumortherapeutika Tumor- oder HIV-infizierte Zelle Tumorantigen oder Virales Hüllprotein Toxin/ Isotop Immunotoxin oder nativer AK kill Killer- T-Zelle TZR Bispezifischer Antikörper kill Retuximab Anti-CD20 AK (B-Lymphome) (http://www.prolife.de/ aktuelles/38.html)

Dr. Michael Schwemmlein Wirkmechanismen therapeutischer Antikörper 4. Transport zytotoxischer Substanzen 3. Komplement- abhängige zell-vermittelte Zytotoxizität (CDC) 5. Blockieren 2. Antikörper-abhängige zellvermittelte Zyto- toxizität (ADCC) Promotionsvortrag 2007 Dr. Michael Schwemmlein FAU Lehrstuhl für Genetik 1. Signalisieren

Katalytische Antikörper (Abzyme) (Richard Lerner, San Diego, 1986; Peter Schultz, Berkely 1986) Conventional Catalytic Antibody Antibody Binds antigen but Binds antigen and cleaves it does not cleave Is regenerated after reaction Is " used " up during reaction

Periodatoxidation von p-Nitro-Toluol-methyl-Sulfid zu Sulfoxid Hapten (Stabiles Analog zum Übergangszustand) Instabiler Übergangszustand Amino- phosphonsäure L.C.Hsieh-Wilson, P.G.Schultz, and R.C.Stevens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:5363-5367 (1996).

Enzymatische Spaltung und Inaktivierung von Kokain (Landy and coworkers, New York 1993) O H C O O 3 N N H C OCH H C 3 N HO 3 3 O OCH 3 OCH 3 O O O O OH + C HO HO Cocaine Unstable Cleavage Products (active) Transition State (inactive) O H C N 3 OCH 3 O O P HO Stable Transition State Analog