Diplomarbeit Sören Werner Untersuchung von Nährmedien zur biotechnologischen Herstellung des kommensalen Escherichia coli L2000 Diplomarbeit Sören Werner Betreuer: Prof. Dr. rer. nat. habil. Th. Bley Prof. Dr.-Ing. D. Eibl Dr. rer. nat. D. Grimmecke

1 Einleitung Escherichia coli Wildstamm mit weitestgehend unbekannter Physiologie Bisher identifizierte Eigenschaften liefern Anhaltspunkte für eine mögliche probiotische Nutzung zur Prävention und Akutbehandlung entzündlicher Darmerkrankungen Gestiegene Anzahl antibiotikaresistenter Krankheitserreger stärkt das Marktpotential probiotischer Pharmakons in Human- und Veterinärmedizin Zusätzlich sind Nebenwirkungen von Antibiotika unerwünscht Ziel → Kultivierung des Stammes mit einer hohen Zelldichte und einer Anpassung an das Milieu „Verdauungstrakt“

2 Theoretischer Überblick Escherischia coli Fakultativ anaerobes, gramnegatives, stäbchenförmiges, nichtsporenbildendes und peritrisch begeißeltes Bakterium aus der Familie der Enterobacteriaceae Medizinische Mikrobiologie unterscheidet kommensale, nichtpathogene und pathogene Stämme Diagnostische Differenzierung beruht auf der serologischen Einteilung von Kauffmann nach O-, H- und K-Antigen

2 Theoretischer Überblick Wachstum von E. coli Heterotrophe Mikroorganismen → Energie aus Oxidation energiereicher organischer Verbindungen Bei E. coli Kohlenhydrate, organische Säuren oder Aminosäuren als Energie- und Kohlenstoffquelle Ammoniumverbindungen oder Aminosäuren als Stickstoffquelle Makroelemente wie Magnesium, Kalium, Eisen und Phosphor essentiell Mikroelemente wie Bor, Mangan, Kupfer, Cobalt, Molybdän in spezifischen Funktionen

2 Theoretischer Überblick Stressantwort von E. coli Allgemeine Stressantwort geregelt durch alternativen s-Faktor S → veränderte RNA-Synthese Säurestressantwort durch Bildung biogener Amine aus korrespondierenden Aminosäuren → dadurch Verbrauch eines Wasserstoffions Aminosäure/Amin-Paare: Glutaminsäure/g-Aminobuttersäure (GABA), Arginin/Agmatin/Putrescin, Ornithin/Putrescin und Lysin/Cadaverin

3 Material und Methoden Kultivierungen Komplexes Nährmedium (Pepton) anaerob in Schüttelkultur (37 °C, 150 rpm, pH-ungeregelt) Komplexes Nährmedium (Pepton, LB) aerob im 15L Bioreaktor von Braun (37 °C, 400-800 rpm, 1-2 vvm, pH 6,8) Wachstum, Substratverbrauch und Produktbildung aufgezeichnet Bildung biogener Amine als Zeichen der Stressadaption durch HPLC-Analyse ermittelt → Physiologie in Bezug auf Stressantwort und Wachstum Nach Medienoptimierung Validierung des Mineralmediums durch Versuche in Analogie zu Komplexmedium

3 Material und Methoden Medienoptimierung Ableitung chemisch definiertes Mineralmedium aus Erkenntnissen von Wachstumsversuchen und Literaturangaben Optimierung in einem Mikrotiterplattenphotometer (Thermo Electron) Mineralmedium aus Glucose, Ammoniumchlorid, Phosphatpuffer, Magnesiumsulfat und Spurenelementen

3 Material und Methoden Analysen Zellzahl und Biotrockenmassekonzentration über Korrelation zur optischen Dichte ermittelt Medienbestandteile mit Bioprofile 300 (Nova Biomedical) untersucht Konzentration biogener Amine und korrespondierender Aminosäuren mittels HPLC (Dionex) bestimmt

4 Ergebnisse Komplexmedium anaerob Wachstum bis zu einer Zelldichte von 0,35 g·L-1 pH-Wert sinkt auf 4,0 Glucoseverbrauch von insgesamt 2,5 g·L-1 (teils auch nach Wachstumsstop) → Metabolismusaktivität Acetat- und Ethanolausschüttung (1,3 g·L-1 bzw. 0,35 g·L-1) auch nach Wachstumsstop Aminausschüttung equimolar und zeitgleich zu Aufnahme von Aminosäuren als Zeichen der Säurestressantwort

4 Ergebnisse Komplexmedium aerob Wachstum bis zu einer Zelldichte von 2,5 g·L-1 pH-Wert geregelt (pH 6,8) Hohe Acetatausschüttung (1,3 g·L-1) trotz ausreichender Sauerstoffsättigung aufgrund hoher Glucosekonzentration (36 g·L-1) Ausschüttung von Cadaverin und Putrescin trotz physiologischem pH-Wert Keine Bildung von g-Aminobuttersäure und Agmatin

4 Ergebnisse Medienentwicklung und -optimierung pH-Wert ungeregelt optimales Wachstum bei Glucosekonzentration von 7,2 g·L-1 Ammoniumchlorid als bevorzugte Stickstoffquelle Aminosäuren mit teils negativen Auswirkungen Zugabe von Vitaminen nahezu ohne Einfluss auf Wachstum

4 Ergebnisse Mineralmedium anaerob Wachstum bis zu einer Zelldichte von ca. 0,15 g·L-1 pH-Wert sinkt auf 4,0 Keine Stressantwort in Form von biogenen Aminen nachweisbar → unbekannte Cofaktoren müssen analysiert werden

4 Ergebnisse Mineralmedium aerob Wachstum bis zu einer Zelldichte von 5 g·L-1 pH-Wert geregelt (pH 6,8) Kaum Acetatausschüttung Vollständiger Verbrauch von Glucose (7,2 g·L-1) Parameter: µmax=0,79 h-1 , YX/Gluc=0,76 g·g-1, KGluc=0,003 g·L-1, YX/NH4+=0,13 g·mmol-1

4 Ergebnisse Aerobe fed-batch-Strategie Wachstum bis zu einer Zelldichte von 60 g·L-1 pH-Wert geregelt (pH 6,8) Acetatausschüttung bei Limitierung durch Sulfatmangel (Stunde 18) Ausschüttung von Cadaverin, Putrescin und g-Aminobuttersäure trotz physiologischem pH-Wert → teilweise konstitutive Bildung Weitere Parameter: YX/PO43+=3,55 g·mmol-1, YX/SO42+=14 g·mmol-1

5 Fazit Zusammenfassung Ausgeprägte Stressantwort durch Biosynthese biogener Amine im Komplexmedium unter anaeroben, nicht pH-geregelten Bedingungen Aufnahme von Aminosäure und Export der korrespondierenden Amine nahezu equimolar und zeitgleich Unter aeroben, pH-konstanten Bedingungen keine Beziehung Medienoptimierung im Mikrotiterplattenphotometer ist ressourcenschonend Optimale Glucosekonzentration 7,2 g·L-1 Mineralmedium mit gutem aerobem Wachstum Säurestressantwort auch bei Zugabe der benötigten Precursoren kaum vorhanden Bei höheren Zelldichten (fed-batch bis 60 g·L-1) unter pH-konstanten Bedingungen Bildung von Aminen → teils konstitutiver Charakter

5 Fazit Ausblick Säurestressantwort im Mineralmedium Assay zur Bestimmung der allgemeinen Stressantwort (ss) Vitalitätsbestimmung Verbesserte Prozessführung mit online-Messung

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