Übungen zu Ökologischen Fragen in der Lebensmittelproduktion mit mikrobiellen Gemeinschaften Haslberger, Handschur

Übungsablauf MO: Vortrag Methoden, DNA-Extraktion u. DNA-Reinigung DI: 1st PCR, nested PCR, Agarosegel, Vorbereitung des DGGE-Gels, DNA-Fällung MI: DGGE, Interprätation der Ergebnisse DO: Extraktion bakterieller DNA aus Blut mittels neuer Extraktionsmethode, DNA-Messung mit UV, PCR (Hanusch Spital)

Inhalt Culture dependent vs. Culture independent Methods PCR RT-PCR DGGE, TGGE SSCP, MSSCP RFLP, TRFLP RISA, ARISA Cloning, Sequencing

2 ways for identification: +/- cultivation Culture Culture- dependent Methods Sample DNA/RNA Culture- independent Methods Identification of Microorganisms

Only 1-5% of bacteria can be identified in ecosystems using methods including cultivation Habitat Cultivability (%) Freshwater 0,25 Brackish water 0,1-3 Sedimente Soil 0,3 Food general 0,5-10

Culturable Wachstumsbedingungen bekannt Keim lebend Temperatur, Nährstoffe, aerob/anaerob Keim lebend Verschiebung der Flora 99% aller Bakterien unbekannt

Culture independent

Culture independent Spezies Sequenz S. aureus CGAA CGG ACG AGA AGC TTG CTT CTC T GAT S. epidermidis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC S. capitis CGAA CAG ACG AGG AGC TTG CTC CTC T GAC S. warneri CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC S. haemolyticus CGAA CAG ATA AGG AGC TTG CTC CTT T GAC

Polymerase Chain Reaction

Realtime-PCR

RT-PCR Fluorescence (F1) Cycle Number 103 cop 104 cop 105 cop 106 cop 100.000 1.000 10.000 45 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 Fluorescence (F1) Cycle Number 106 cop 105 cop 104 cop 103 cop

RT-PCR

Denaturant Gradient Gel Electrophoresis

Denaturant Gradient Gel Electrophoresis

Temperature Gradient Gel Electrophoresis Prinzip wie DGGE Keine DNA- denaturierende Substanzen Temperatur Gradient

Singlestrand Conformatiom Polymorphism DNA denaturierende Substanzen der Probe zugesetzt  ssDNA Unterschiedliche Konformation der ssDNA beeinflusst Laufgeschwindigkeit im Gel

SSCP

Multitemperature Singlestrand Comformation Polymorphism ssDNA Denaturants added to PCR- product Different bands because of different conformation of ssDNA Temperature is changing during the electrophoresis Using high voltage

MSSCP

Temperatur changing during run 5´ 22°C 10°C 2´ Zeit

MSSCP SSCP bei untersch. Temp. SSCP m. wechselnder Temp.= MSSCP

MSSCP

(Terminal) Restriction Fragment Length Polymorphism

Cutting enzymes HIND III A/AGCTT BAM HI TGG/CCA Eco RI GT/AATTC 1) -AGTTGG CCAAGCTTTGCTTAGGC 2) -AGGTCCTGATGA AGCTTGGTTAT 3 ) -TTTGG CCATTA AGCTT AGT AATTC 1) 2) 3) 1) + 2) + 3)

(Automated) Ribosomal Intergenic Spacer Analysis dsDNA between 16 S and 23 S rRNA-Gene (Intergenic Spacer) Fluorescently primers Different bands because of different length of PCR- product

Sensitivity DGGE: 95 - 100% 100-700 bp SSCP: 80 - 85 % 100-500 bp MSSCP: 85 - 95% 100-500 bp [T]RFLP: 90 – 100% 100-10000 bp [A]RISA: 95 - 100% 200-1200 bp

Membran Hybridisierungsverfahren Target DNA Northern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird RNA nachgewiesen Southern Blot: Mit DNA-/RNA-Sonden wird DNA nachgewiesen Y Western Blot: Mit markiertem Antibody wird Protein nachgewiesen

Monitoring Community fingerprints Identification of microorganisms Methode Monitoring Community fingerprints Food samples Comparison of bandpatterns DNA extraction PCR DGGE Screenig for different clones and sequencing Identification of microorganisms Clone libraries

PCR Klonierung DGGE Amplifikation der 16S rDNA 600 –1300 bp 1. Runde PCR (lange Fragmente) Klonierung 200 – 500 bp Nested PCR Einer der Primer trägt am 5‘-Ende eine GC-clamp. DGGE

Agarosegel

DGGE

Cloning Extrahierte DNA ~ 700 bp PCR Amplifikation der langen Fragmente Ligation BHI-Agar + Tet + Amp + IPTG + X-Gal

Cloning Lactose --> Galactose + Glc X-Gal --> blau (Kolonien blau) Lac Z ß-Galactosidase Lactose X-Gal (Kolonien weiß) klonierte DNA

Blue/white screening

Clone screening

Sequenzierung

Sequenzierung

FASTA run 98% Similarity Speziesgrenze 96% Similarity Genusgrenze Alignment DB:ID Source Length Identity% Ungapped% EM_PRO:AB012212 Enterococcus faecalis gene 1517 99.719 100.000 356 8e-57 10 EM_PRO:AB036835 Enterococcus faecalis gene 1518 100.000 100.000 356 1.2e-57 45 EM_PRO:AB092693 Enterococcus faecalis gene 1455 100.000 100.000 329 9.6e-53 18 EM_PRO:AB098122 Enterococcus faecalis gene 1466 99.719 100.000 356 2e-57 30 EM_PRO:AB100597 Enterococcus faecalis gene 394 100.000 100.000 356 2.9e-57 ....... EM_PRO:AB101658 Streptococcus epidermidis g 197 69.854 70.1000 245 2e-48 31 98% Similarity Speziesgrenze 96% Similarity Genusgrenze http://www.ebi.ac.uk/fasta33/nucleotide.html

Tendogramm Clone http://rdp8.cme.msu.edu/html/index.html

Fragestellung Verursachen alle (kultivierbare/nicht-kultivierbare) MOs im Blut klinische Probleme? Welche nicht-kultivierbaren MOs sind im Blut neutropenischer/septitischer Patienten? Woher kommen diese MOs/Wie gelangen sie ins Blut des Patienten? Was kann man dagegen tun? KLINISCHE BEDEUTUNG

Wozu molekulare Analyse ? Blutkultur oft negativ Gewisse Menge an Keimen muss vorhanden sein Keime müssen kultivierbar sein Zeit Probenmenge 99% der Bakterien weltweit sind unbekannt NUR 1% ALLER BEKANNTEN BAKTERIEN WACHSEN UNTER LABORBEDINGUNGEN

Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut Gelelektrophorese

Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut Gelelektrophorese Enterobacteriaceae/Pseudomonadaceae specific Primers Staphylococcus specific Primers

Probleme bei der Extraktion bakterieller DNA aus Vollblut DGGE

Lokalisierung der Bakterien im Blut: Fluorescents Insitu Hybridisation unspiked spiked m. E.coli u. S.flexneri E.coli- Sonde Shigella- Sonde

Spezielle DNA- Extraktionsmethode Selektive Lyse der Blutzellen Verdau der Blut- DNA Inaktivierung der DNase Lyse der Bakterienzellen Reinigung der bakteriellen DNA Extraction Protocol in cooperation with Fa. MOLZYM

Spezielle DNA- Extraktionsmethode Gelelektrophorese

Spezielle DNA- Extraktionsmethode

Spezielle DNA- Extraktionsmethode DGGE

Abwesenheit v. Blut-DNA

Sensitivität