Diagnostik Immundefekte Dr. sc. nat. Maya Vonow-Eisenring, FAMH

Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Routine Diagnostik Warnzeichen für PID bei Erwachsenen: Pathologische Infekt-Anfälligkeit Vermehrter Gebrauch von Antibiotischen Therapien Unbeabsichtigter Gewichtsverlust, meist mit Diarrhoe Impfkomplikationen bei Lebendimpfungen Positive Familienanamnese für PID Auffälliges Labor: Lymphopenie, Neutropenie, verminderte Immunglobuline,… CRP BSG Erythrozyten Thrombozyten Differentialblutbild Immunglobuline ↓↓↓ trotz schwerem bakt. Infekt? Anämie? Thrombozytopenie? Neutropenie? / Eosinophilie? / Lymphopenie? Einzelne Ig’s oder auch alle ↓↓↓ ? CAVE: zum Teil auch einzelne Ig’s ↑ Lymphozyten Subpopulationen

Methodik: Durchflusszytometrie Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik FSC SSC DotPlot Methodik: Durchflusszytometrie Elektronisches System Optisches System Durchflusszelle = dünne Messkammer Elektrischer Impuls Laser optisches Signal Detektor Digital/Analog Konverter Flüssigkeitssystem Wasserstrahl mit einzelnen hintereinander gereihten Zellen Hydrodynamische Fokussierung durch laminare Mantel-Strömung (Hüllstrom) > Grundsätzlich alle Partikel bis 100 μm messbar (auch Bakterien & Pilze) Sheath Fluid Trägerflüssigkeit, trifft am Ende der Kapillare auf Probe und beschleunigt diese Stahlkapillare Probe mit Zellen

Methodik: Durchflusszytometrie Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Methodik: Durchflusszytometrie Durchflusszelle http://www.precisioncells.com Laser B optisches Signal Optische Signale bzw. Messbare Parameter: Streulicht Vorwärtsstreulicht (FSC) > relative Grösse Seitwärtsstreulicht (SSC) > relative Granularität bzw. interne Komplexität spezifische Fluoreszenz (FL1, FL2, FL3, FL4…) > AG-Spezifität entsprechende relative Fluoreszenzintensität > Menge an AG

Methodik: Durchflusszytometrie Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Methodik: Durchflusszytometrie Darstellung > Zellen der selben Population zeigen ähnliche Streulicht-Eigenschaften und bilden Anhäufungen im Dot-Plot Lymphozyten Monozyten Granulozyten B Lymphozyten: klein, kaum Granula Monozyten: gross, kaum Granula Granulozyten: gross, viel Granula T M N E B

Material & Präanalytik Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Material & Präanalytik MATERIAL Vollblut - muss frisch sein (nicht fixiert oder zu alt) - antikoaguliert in EDTA (oder Heparin) => Probe sollte nach Abnahme innert 18 Stunden bei uns im Labor eintreffen, damit genügend Zeit für deren Bearbeitung und Analyse bleibt. PRÄANALYTIK EDTA-Vollblut: RT (18-22°C) > 37°C Zerstörung der Zellen < 22°C Abfall der Zellen (vor allem T-Helferzellen)

PID Diagnostik Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Lymphozyten-Subpopulationen Analyse (T,B,NK) Inhibitory R. TCR Activating R. CD3 CD45 CD16 CD45 CD4 CD56 NK-Zellen CD4+ T-Zellen NK TH CD4 CD8 B NK CD8+ T-Zellen BCR CD79 A/B B-Zellen BCR CD45 TCR CD3 CD21 CD19 CD81 CD45 CD8 B grobe Verteilung in Erwachsenen CAVE: altersspezifische Normwerte CAVE: Quantität sagt nichts über Funktionalität aus CD20 TC

PID Diagnostik Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Lymphozyten-Subpopulationen Analyse (T,B,NK) Ermöglicht keine genaue Diagnostik der PID’s, kann aber evtl. die Richtung weisen… Immunologischer Phänotyp Mögliche kombinierte Immundefekte T- B+ NK- IL-Rγc-Kette, JAK3, PNP T- B+ NK+ IL-7Rβ T- B- NK+ RAG-1, RAG-2, Artemis T- B- NK- ADA, Retikuläre Dysgenesie T+ B- NK+ Omenn-Syndrom, IL-2Rβ CD4- B+ NK+ MHC Klasse II CD8- B+ NK+ ZAP-70, TAP-2 / MHC Klasse I, CD8α

PID: Weiterführende Diagnostik Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik PID: Weiterführende Diagnostik Verdacht auf: Defekt im T-Zell-System? Defekt im B-Zell-System? NK-Zell-Defekt? Phagozytensystem-Defekt? Defekt im Komplementsystem? Proliferationstest, Treg, Zytokinbildung periphere B-Zell-Differenzierung Zytotoxizitäts-Test, Degranulationstest Funktionstests (Phagozytosetest, Burst-Test, Chemotaxis) Komplement-Funktionstest, Einzel-Bestandteile Genetische Untersuchungen zum Nachweis der Mutation

Weiterführende Diagnostik bei V.a. Defekt im T-Zell-System Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Weiterführende Diagnostik bei V.a. Defekt im T-Zell-System F low Cytometric A ssay of S pecific C ell-mediated I mmune response in A ctivated whole blood 1-wöchige Inkubation von Vollblut in Medium mit diversen Stimuli-Zusätzen durchflusszytometrische Analyse von allfälliger Lymphozyten-Proliferation grobe phänotypische Einteilung der proliferierenden Zellen (CD3-CD4-CD8) CAVE: Immunsuppressive Therapien haben Effekte auf Zell-Funktion und Proliferation! Keine absolute Korrelation zwischen T-Zell Proliferation in vitro und klinisch signifikanten Immundefekten!

Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik FASCIA Stimulation mit: Mitogen: T-Zell-Aktivierung ohne APCs via TCR-Crosslinking Superantigen: T-Zell-Aktivierung via MHC II - TCR (Vβ) Bindung Spezifische Stimuli: T-Zell-Aktivierung via MHC I / II - TCR (Vα/Vβ) Bindung Macias et al., J Am Acad Dermatol 2011;64:455-72

Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik FASCIA Medium only Pokeweed Mitogen (PWM) Concanavalin A (ConA) Enterotoxin A&B (SEA/SEB)

Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik FASCIA Spezifische Stimuli Positive zelluläre Reaktivität bei… Tuberkulin (PPD, Tuberculin-purified protein derivative) Tuberkulose-Infektion Tuberkulose-Impfung (BCG-Impfung) – nicht standardmässig Tuberkulin-Hauttest mit PPD-Injektion Tetanus Toxoid (Formalin-inaktiviert Toxoidimpfstoff) Wundstarrkrampf-Infektion Neugeborenen-Impfung (CH-Impfplan) Auffrischimpfung alle 20-10 Jahre Varilrix (attenuierter VZV Lebendimpfstoff) VZV-Infektion (ca. 95% der Bevölkerung betroffen) Nachholimpfung bei neg anamnestischer Durchseuchung bei jungen Erwachsenen Vorbeugende Impfung bei Risiko-Personen ohne Immunität Prevenar 13 (T-Zell abhängiger Pneumokokkenpolysaccharid-Konjugatimpfstoff ) Pneumokokken-Infektion Ergänzende empfohlene Neugeborenen Impfung Impfung bei Personen mit erhöhtem Risiko für invasive Pneumokokken-Infektionen Candida albicans Opportunistischer Erreger im Darm der meisten Menschen Herpes Simplex 1 und 2 Ag HSV-Infektion (ca. 70% bzw. 20% der Bevölkerung betroffen) Cytomegalovirus Ag CMV-Infektion (ca. 80% der 30-Jährigen in Industriestaaten betroffen) Epstein-Barr-Virus (P3H3 Cell Extract) EBV-Infektion (ca. 98% der über 40 Jährigen betroffen) Adenovirus Ag ADV-Infektion (weltweite Verbreitung)

Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik FASCIA gesundes Spenderblut

Weiterführende Diagnostik bei V.a. Defekt im B-Zell-System Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Weiterführende Diagnostik bei V.a. Defekt im B-Zell-System Untersuchung der peripheren B-Zell-Differenzierung Einteilung der heterogenen CVID-Gruppe auf Grund von Durchflusszytometrie (Consensus Classification: EUROClass, Wehr et al.) Zusätzlich Einteilung in Gruppen mit bestimmten Risiko-Prävalenzen  erlaubt schnellere Erkennung von häufigen sekundären Komplikationen wie Splenomegalie, Lymphadenopathie und granulomatösen Erkrankungen.

 Periphere Reifung der B-Zelle – peripheres Blut / SLOs Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik  Periphere Reifung der B-Zelle – peripheres Blut / SLOs Knochenmark Peripheres Blut SLO Periphere B-Zellreifung IgM IgM IgM CD19 + CD20 + CD24 high CD27 - CD38 high CD19 + CD20 + CD24 + CD27 - CD38 + CD19 + CD20 + CD24 low CD27 - CD38 low Immature B Tr B mature B IgD IgD KM Transitorische B-Zellen: B-Zellen die kürzlich das Knochenmark verlassen haben <5% der B Zellen im Blut Erwachsener höhere Anzahl findet man in Blut von Kinder oder nach HSCT Transitorische Marker wie CD24, CD38 und IgM gehen allmählich während der Entwicklung zur reifen B-Zelle verloren/werden runterreguliert => Einteilung in zwei aufeinanderfolgende Stadien: T1 & T2 B cells pB IgM IgM CD19 + CD20 high CD21 low CD24 high CD27 - CD38 high CD19 + CD20 + CD21 + CD24 int CD27 - CD38 int Tr 1 Tr 2 IgD IgD

Periphere Reifung der B-Zelle – peripheres Blut / SLOs Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Periphere Reifung der B-Zelle – peripheres Blut / SLOs Peripheres Blut SLO Peripheres Blut Periphere B-Zellreifung CD19 + CD20 + CD27 + CD38 low memory B CCR7 CXCR5 IgG IgM mature naive B Antigen Begegnung B-Zell Eintritt in primäre Follikel activated B activated B GCR IgG IgD IgD IgD Plasma Blast Plasma Zelle Helfer T CD19 + CD20 - CD27 + CD38 high Hypermutation Selektion GerminalCenter Reaction in sekundären Follikeln CXCR4 Expression > Zeigt richtigen Weg im Keimzentrum ‘dunkle Zone’ mit schnell proliferierenden Zentroblasten Affinity Maturation   BCR Affinität Ig-Klassenwechsel  verschiedene Effektor Funktionen ‘helle Zone’ mit nicht-proliferierenden Zentrozyten Lizenzierung durch FDC&TFH (kompetitives Selektionsverfahren) CXCR4low CXCR4high Zentro- blast Zentro- zyt IgG IgG

Periphere B-Zellen im Blut Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Periphere B-Zellen im Blut Transitorische B-Zellen Naive / mature B-Zellen => zirkulieren bis sie Ag begegnen oder in Apoptose gehen memory B-Zellen => rezirkulieren im Ruhezustand bis sie Ag wieder begegnen IgM/IgD (Ursprung noch nicht ganz klar) klassengewechselt (Ursprung via GCR) Zirkulierende Plasmablasten IgG IgM IgM mature naive B Tr memory B Plasma Blast IgD IgD IgG CD19 + CD20 + CD21 + CD24 + CD27 - CD38 high CD19 + CD20 + CD21 + CD24 low CD27 - CD38 low CD19 + CD20 + CD21 + CD27 + CD38 low CD19 + CD20 – CD21 low CD27 + CD38 high Perez-Andres et al. 2010

Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik CD21 low B-Zellen Gesunder Spender CD21 = complement receptor 2 (CR2) Teil des Co-Rezeptorkomplex (CD21/CD19/CD81) zum BCR Gleichzeitiges Triggering von BCR und CD21 vermindert Threshold für B-Zell-Aktivierung Thorarinsdottir et al., Scandinavian Journal of Immunology, 2015, 82, 254–261

Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik CD21 low B-Zellen Gesunder Spender pathologisch CD21 = complement receptor 2 (CR2) Teil des Co-Rezeptorkomplex (CD21/CD19/CD81) zum BCR Gleichzeitiges Triggering von BCR und CD21 vermindert Threshold für B-Zell-Aktivierung Ursprung & Funktion noch nicht vollständig geklärt: exhausted vs. anergic vs. nonclassical B-Zellen CD27- vs. CD27+ IgM vs. Ig-Switch Thorarinsdottir et al., Scandinavian Journal of Immunology, 2015, 82, 254–261

Untersuchung der peripheren B-Zell-Differenzierung Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Untersuchung der peripheren B-Zell-Differenzierung Gesunder Spender CVID Systemische Sklerose naive switched memory PID mit  Switched memory B-Zellen => GerminalCenter Reaktion Defekt / fehlende T-Zell Hilfe? CAVE: nicht spezifisch für PID bzw. CVID!

Untersuchung der peripheren B-Zell-Differenzierung Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Untersuchung der peripheren B-Zell-Differenzierung Gesunder Spender CVID CVID Trans B naive Systemische Sklerose PID mit ↑ Transitorische B-Zellen => Erhöhte Prävalenz für Lymphadenopathie im Rahmen des CVID’s CAVE: nicht spezifisch für PID bzw. CVID!

Untersuchung der peripheren B-Zell-Differenzierung Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Untersuchung der peripheren B-Zell-Differenzierung Gesunder Spender CVID CVID CD21 low B-Zell-Lymphom PID mit ↑ CD21 low B-Zellen => Erhöhte Prävalenz für Splenomegalie im Rahmen des CVID’s CAVE: nicht spezifisch für PID bzw. CVID!

Klinik für Immunologie – Zelluläre Diagnostik Das zelluläre Team Linda Olsson Annelise Eng Iris Meyer Ramona Derrer Franziska Paolinelli Astrid Koster

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