Alloreaktivität vorhersagen Dipl. Biol. Michaela Fischer Transplantations- und Infektionsimmunologie, AG Prof. M. Sester, Campus Homburg 40. Preisverleihung und Jahrestreffen der C.E. Alken-Preisträger 25.11.2016

Abstoßungsreaktionen Hyperakut (innerhalb von Minuten) Akut (innerhalb von Tagen/Wochen) Chronisch (innerhalb von Monaten/Jahren)

Präformierte HLA-Antikörper Präformierte HLA-AK können entstehen durch immunisierende Ereignisse: Schwangerschaft Bluttransfusion Transplantation Infektionen (Kreuzreaktivitäten)

Nachweis präformierte Antikörper Humoral bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch Antikörper-Vorhersage mittels: Mikrolymphozytotoxische Tests CDC-Crossmatch Flow-Crossmatch Festphasen-Immunassays ELISA Luminex Gäbe noch: nach Terasaki Monoconal antibody immobilization of lymphocyte antigens – MAILA Single Antigen Immunoassay (entweder ELISA oder Bead-basierte Multiplexanalyse  Luminex) Lymphozytenimmunfluoreszenztest (LIFT)

Vorhersage T Zell vermittelter Abstoßungen?

T Zell vermittelte Abstoßung Nankivell und Alexander (2010) N Engl J Med 363: 1451

Nachweis präformierter T-Zellen Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch: Limiting-Dilution Analyse Proliferationsassay - CFSE Langzeit-Assays (Proliferation von mehreren Tagen)

Nachweis präformierter T-Zellen Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch: Limiting-Dilution Analyse Proliferationsassay - CFSE ELISPOT AlloFlow Langzeit-Assays (Proliferation von mehreren Tagen) Kurzzeit-Assays (8-24h)

Nachweis präformierter T-Zellen Zellulär bedingte Abstoßungsreaktionen vermeiden durch: Limiting-Dilution Analyse Proliferationsassay - CFSE ELISPOT AlloFlow Langzeit-Assays (Proliferation von mehreren Tagen) Kurzzeit-Assays (8-24h)

ELISPOT Anti-IFNγ AK T-cell immune monitoring by the ELISPOT assay for interferon gamma Joshua J. Augustine, Donald E. Hricik, Spenderzellen immortalisiert Zeitaufwand 24h 10

ELISPOT Anti-IFNγ AK Empfängerlymphozyten T-cell immune monitoring by the ELISPOT assay for interferon gamma Joshua J. Augustine, Donald E. Hricik, Spenderzellen immortalisiert Zeitaufwand 24h Empfängerlymphozyten Spenderlymphozyten mit Antigen 11

ELISPOT Anti-IFNγ AK Empfängerlymphozyten T-cell immune monitoring by the ELISPOT assay for interferon gamma Joshua J. Augustine, Donald E. Hricik, Spenderzellen immortalisiert Zeitaufwand 24h Empfängerlymphozyten Spenderlymphozyten mit Antigen Sezerniertes IFNγ 12

ELISPOT Ergebnisse nach 16-24h Anti-IFNγ AK Empfängerlymphozyten T-cell immune monitoring by the ELISPOT assay for interferon gamma Joshua J. Augustine, Donald E. Hricik, Spenderzellen immortalisiert Zeitaufwand 24h Empfängerlymphozyten Spenderlymphozyten mit Antigen Sezerniertes IFNγ Enzymgekoppelter Sekundär-AK Augustine (2012) Clinica Chimica Acta 413: 1359–1363 13

ELISPOT - Outcome Augustine (2007) J Am Soc Nephrol 18: 1602–1606 Hemodialysis Vintage, Black Ethnicity, and Pretransplantation Antidonor Cellular Immunity in Kidney Transplant Recipients Joshua J. Augustine,* Emilio D. Poggio,† Michael Clemente,‡ Mark I. Aeder,§ Kenneth A. Bodziak,* James A. Schulak,§ Peter S. Heeger,‡ and Donald E. Hricik* *Division of Nephrology and Hypertension and §Department of Surgery, University Hospitals Case Medical 2007 Augustine (2007) J Am Soc Nephrol 18: 1602–1606

Nachweis präformierter Alloreaktivität aus Vollblut - AlloFlow Spender Empfänger 500µl Vollblut 700µl Vollblut Vorteile Vollblutassay Geringes Probenvolumen 8h bis zum Ergebnis Vorfärbung aCD45 APC Waschschritte Je 500µl Blut von Spender und Empfänger Zunächst wurde die Technik mit PBMC etabliert, jedoch nun auf die Verwendung von Vollblut abgewandelt, so dass ein geringes Probenvolumen ausreichend ist und insgesamt bereits nach 8h (6h Stimulation plus knapp 2 h Verarbeitungszeit) ein Ergebnis vorliegt. aCD28 aCD49d Brefeldin A Spenderblut + Empfängerblut 2h 4h 1ml Analyse im Durchflusszytometer

AlloFlow – Vollblut-Assay IFN-γ Spender Zellen Empfänger Zellen Alloreaktive CD4 oder CD8 T-Zellen Spender CD45 CD69 Empfänger IFN-γ IFN-γ Fischer et al., eingereicht

Transplantationskandidaten zeigen eine verstärkte CD4 und CD8 T-Zell Alloreaktivität ≥DL, n (%) 34 (4,66%) 15 (1,97%) <DL, n (%) 696 (95,34%) 746 (98,03%) ≥DL, n (%) 124 (16,99%) 53 (6,96%) <DL, n (%) 606 (83,01%) 708 (93,04%) p=0,005 p<0,0001 Fischer et al., eingereicht

Interindividuelle Unterschiede beim Auftreten alloreaktiver CD8 T-Zell Frequenzen hohe Reaktivität CD8 Keine Reaktivität Moderate Reaktivität % alloreaktiver CD8 T-Zellen Nierentransplantat-Warteliste-Kandidaten dialysis patients Fischer et al., eingereicht

Interindividuelle Unterschiede beim Auftreten alloreaktiver CD8 T-Zell Frequenzen hohe Reaktivität CD8 Keine Reaktivität Moderate Reaktivität % alloreaktiver CD8 T-Zellen Nierentransplantat-Warteliste-Kandidaten dialysis patients Fischer et al., eingereicht

Interindividuelle Unterschiede beim Auftreten alloreaktiver CD8 T-Zell Frequenzen hohe Reaktivität CD8 Keine Reaktivität Moderate Reaktivität % alloreaktiver CD8 T-Zellen Nierentransplantat-Warteliste-Kandidaten dialysis patients Fischer et al., eingereicht

Pilotstudie: Zusammenhang präformierter zellulärer Alloreaktivität mit akuten zellulären Abstoßungsereignissen nach Transplantation Fischer et al., eingereicht

Deutschlandweite Multicenter Studie: Die Rolle präformierter alloreaktiver T-Zellen vor Transplantation im Zusammenhang mit dem Transplantat-Outcome Alloreaktion als Vorhersageparameter/Prädiktor für Transplantat-Outcome? Beobachtungsstudie ohne Intervention Ziel: 150 Nieren-Lebendspenden 8-12 Transplantationszentren in Deutschland 24 Patienten wurden bereits eingeschlossen (6 aus Homburg, 6 aus Frankfurt, 5 aus Tübingen, 4 aus Gießen, 3 aus Aachen und 1 aus Lübeck) 28 Patienten mit T Zell Alloreaktivität angestrebt Clinicaltrials.gov #NCT02633826

Studienziel - Multicenterstudie Nachweis präformierter Alloreaktivität bei Patienten vor Nierentransplantation durch Lebendspender Nachweis Donor-spezifischer Antikörper vor und im Verlauf nach Transplantation Korrelation mit klinischen Daten zur Transplantatfunktion Empfänger und Spender 9 ml (T Zellen) Klinische Daten Monate nach Transplantation 0 (Tx) 3 6 12 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten Empfänger

Studienziel - Multicenterstudie Nachweis präformierter Alloreaktivität bei Patienten vor Nierentransplantation durch Lebendspender Nachweis Donor-spezifischer Antikörper vor und im Verlauf nach Transplantation Korrelation mit klinischen Daten zur Transplantatfunktion Empfänger und Spender 9 ml (T Zellen) Klinische Daten Monate nach Transplantation 0 (Tx) 3 6 12 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten Empfänger

Studienziel - Multicenterstudie Nachweis präformierter Alloreaktivität bei Patienten vor Nierentransplantation durch Lebendspender Nachweis Donor-spezifischer Antikörper vor und im Verlauf nach Transplantation Korrelation mit klinischen Daten zur Transplantatfunktion Empfänger und Spender 9 ml (T Zellen) Klinische Daten Monate nach Transplantation 0 (Tx) 3 6 12 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten 5 ml (DSA) Klinische Daten Empfänger

Zusammenfassung/Ausblick Methoden zur Vorhersage von präformierten AK vor einer Transplantation sind sehr gut geeignet, um Antikörper-vermittelte Abstoßungsreaktionen zu verhindern Methoden zur Vorhersage einer präformierten zellulären Alloreaktivität waren bisher aufwendig und daher ungeeignet für die klinische Routine 5-10% T-zellulär vermittelten Abstoßungen Multicenter-Studie zur Anwendung der AlloFlow Methode zur Vorhersage präformierter T Zellen  klinisches Outcome

Lieben Dank für Ihre Aufmerksamkeit Cartoonstock.com Stem Cell Transplants Risky But Effective Initial results from the HALT-MS trial suggest that autologous hematopoietic stem cell transplantation may be a highly effective treatment for patients with aggressive relapsing-remitting MS. However, some worry that the aggressive therapy is needlessly risky when safer alternatives are available and may be just as effective. Cynthia McKelvey http://www.google.de/imgres?imgurl=http%3A%2F%2F1.bp.blogspot.com%2F-vgGP_BMr4CI%2FVBdtNmY6vEI%2FAAAAAAAAA_c%2FwLNjS2v_SUk%2Fs1600%2FWhite_blood_cell_eating_germs_by_ShyDude28.jpg&imgrefurl=http%3A%2F%2Fwww.worldaccordingtolupus.co.uk%2F&h=669&w=900&tbnid=Ea6od4Q2rL2QUM%3A&docid=nByax3ZG3quvNM&itg=1&ei=s9ZBVrbgNMzXUeOhgZAE&tbm=isch&iact=rc&uact=3&dur=634&page=5&start=82&ndsp=22&ved=0CLsCEK0DMF5qFQoTCPaF6PLhhckCFcxrFAod41AAQg