החדרת גנים (דנ"א) לתאים של בע"ח ואדם נושא 5 שקופיות 51 - 92 החדרת גנים (דנ"א) לתאים של בע"ח ואדם למטרות : הנדסה גנטית של תאי בע"ח (חלופי למיקרואורגניזמים) ייצור תוצרים מסחריים ריפוי גני של מחלות גנטיות באדם יצירת בע"ח טרנסגנים חיסון בדנ"א מחקר גנטי מחקר על וויסות גנים וביטויים שיבוט בע"ח ריפוי גני ייצור בע"ח ביו -ריאקטור ייצור בע"ח טרנסגני תרכיבי חיסון להמונים 51

שיטות החדרה של גנים (דנ"א) לתאי בע"ח שיטות החדרה של גנים (דנ"א) לתאי בע"ח טרנספקציה = transfection 1 החדרת דנ"א זר ישירות או באמצעות פלסמיד לתאי בע"ח , כאשר : הדנ"א ערום הדנ"א נמצא בתצמיד עם חלבון הדנ"א- מחובר לנשא פלסמידי ( וקטור חיידקי ) שלבי חדירה שונים בטרנספקציה : ספיחה של הדנ"א ע"י קרום תא המטרה פגוציטוזה של הדנ"א והחדרתו לציטופלסמה חדירת הדנ"א לגרעין – ללא השתלבות בגנום התא : אפשרות לביטוי זמני למספר ימים (הגן המוחדר לא עובר שיכפול בזמן חלוקת התאים ולכן נעלם לאחר מספר ימים) חדירת הדנ"א לגנום התא - והשתלבות בכרומוזום התא: אפשרות לביטוי יציב , לטווח זמן ארוך. מתקבל תא רקומביננטי . (הגן מוכפל יחד עם הגנום בזמן חלוקת התא. ויש ריבוי של הגן המוחדר ). חשוב לדעת : ההשתלבות בגנום בד"כ ב % קטן מהתאים ( עד 10% תאים רקומביננטיים ) אתר ההשתלבות בכרומוזום בד"כ אקראי בידוד התא הרקומביננטי נעשה במצע בררני מתאים 52

אמצעים לשיפור הטרנספקציה השקעת הדנ"א במלח סידן זרחתי – מסייע בריכוז דנ"א על קרום התא - משפר ספיחה ומסייע לפגוציטוזה (שיטה כימית) ערבוב הדנ"א עם לפידים - מסייע בחדירתו ( מסיסותו ) דרך הקרום השומני של התא ( שיטה כימית ). שימוש באלקטרופורציה – החדרת הדנ"א בשדה חשמלי היוצר פתחים עדינים (תעלות) בקרום.(שיטה פיסיקלית). אין צורך בהשקעה במלח ואין שלב ספיחה ( יתרון ). אך יש סכנת פגיעה בתאים ( חסרון ). שימוש במיקרו הזרקה – החדרה ישירה של דנ"א לגרעין התא,בפיפטת זכוכית זעירה ובסיוע מיקרוסקופ. ההחדרה מתבצעת לכל תא בנפרד (חסרון ). אך היעילות גבוהה ( 10%-30% ) והביטוי כרומוזומלי יציב ( יתרונות ). מיקרוהזרקה ישירה לגרעין בחירת השיטה נעשית בהתאם לסוג התא וליכולתו לקלוט דנ"א אמצעים לשיפור טרנספקציה http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/transform.htm http://www.tritechresearch.com/ScientistCG/P001211.htm http://www.jyi.org/volumes/volume5/issue5/features/lovejoy.html 53

אופן ביטוי הגן תלוי בשלב של חדירת הדנ"א ובהעברתו לגרעין התא אופן ביטוי הגן תלוי בשלב של חדירת הדנ"א ובהעברתו לגרעין התא גרעין התא ציטופלסמה 4 גנום 3 2 קרום התא ביטוי יציב תורשתי 1 ביטוי זמני גן השלבים בחדירת גן לתא בע"ח : הדנ"א נספח לקרום התא הדנ"א חדר לציטופלסמה הדנ"א חדר לגרעין התא אך לא משתלב בגנום התאי הדנ"א חדר לגנום התא והשתלב בו 54

העשרה 55 סוג תרביות תאים שניתן לרכוש מחברה מסחרית למטרות יישומיות http://www.hansei.com/products/products02.htm כלים לגידול תאים בתרבית הניתנים לרכישה בחברה מסחרית http://www.hansei.com/products/products02_02.htm גידול תרביות עור לשיווק מסחרי למטרות חקר השפעת חומרים קוסמטיים על העור http://www.invitrobiotec.de/3d_gewebe_e.htm http://www.bodysculptor.biz/en/visage/preuves.htm http://www.biocytex.fr/biblio/com/toposkin/toposkin.htm גידול תאים על מיקרונשאים לייצור אינטרפרון בקנה מידה גדול http://www.cellon.lu/microcarriers/immobasil אינטרפרון – פעילות רפואית אנטי וירלית, פועל באופן בלתי ספציפי נגד כל נגיף . http://www.cat.cc.md.us/courses/bio141/lecguide/unit1/prostruct/cytokines/u3fg42a.html http://gsbs.utmb.edu/microbook/ch049.htm http://www.kcom.edu/faculty/chamberlain/Website/Lects/Interfer.htm אבחון של נגיפים בתרבית תאים http://www.herpesdiagnosis.com/diagnose.html http://www.vet.uga.edu/IVCVM/1998/steffens/steffens.htm אנימציה של הדבקת תרבית תאים בנגיף ( גידול נגיפים) http://www.hhmi.org/biointeractive/animations/infection/inf_middle_frames.htm 55

איחוי תאים להחדרת מאקרומולקולות – איחוי פרוטופלסטים 2 פרוטופלסטים הם תאי צמח ללא דופן, בעלי קרום בלבד. ספרופלסטים הם תאי חיידק ללא דופן. הפרוטופלסטים והספרופלסטים דורשים תמיסה איזוטונית כדי לשרוד בתרבית מכינים ספרופלסטים של חיידקים רקומביננטיים ( הנושאים את גן המטרה ) ע"י הסרת הדופן בעזרת ליזוזים במצע איזוטוני . מבצעים איחוי של תאי בע"ח יונק עם הספרופלסטים של החיידק הרקומביננטי במצע איזוטוני , בתוספת פוליאתילן גליקול . מתקבלים תאי כלאיים ( תאי היברידומה ) השונים בתכולתם הגנטית. ברירה של ההיברידומה הרצויה על מצע בררני ( תאי הכלאיים המכילים את גן המטרה + גן ברירה ) פרוטופלסטים או ספרופלסטים איחוי מצע איזוטוני PEG + תא-כלאיים 56 http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29c.htm

טרנסדוקציה החדרת דנ"א לתא בע"ח בעזרת וירוס 3 החדרת דנ"א לתא בע"ח בעזרת וירוס זהו תהליך טבעי שבו הנגיף מדביק את התא ומחדיר את הגנום שלו לגרעין התא המודבק. גנום הנגיף משתלב בגנום תא המטרה וע"י כך משמש וקטור להחדרת הגן . נגיפים המשמשים וקטור הם : נגיפי רטרו ווירוס נגיפי אדנו ווירוס נגיף SV40 נגיף ה הרפס גנום נגיפי מהונדס רקומביננטי גרעין התא נגיף 57 תרבית קווי תאים עילאיים ( אדם, בע"ח, צמח )

תאים של בע"ח שקלטו נשא -דנ"א בגנום התאי והגן מתבטא באופן יציב שילוב תכונות חיוניות נוספות בנשא לצורך ברירת התאים הרקומביננטיים וקבלת התוצר החלבוני תאים של בע"ח שקלטו נשא -דנ"א בגנום התאי והגן מתבטא באופן יציב מאותרים ועוברים ברירה מתוך האוכלוסייה הכללית של התאים: בעזרת גן ברירה על הנשא ( מאפשר את הסלקציה ) ובעזרת גן מדווח על הנשא ( מאפשר איתור התאים) בדיקת רמת הביטוי של הגן ,המוחדר לתאים המהונדסים, תלויה בנוכחות רצפי בקרה על הנשא : פרומוטור יעיל לפני אתר השיבוט רצף מגביר שעתוק רצף בקרה המגיב לחלבון ספציפי המפעיל בקרה חיובית או בקרה שלילית בדיקת פעילות ביולוגית של תוצר הגן המשובט תלויה ב : קיום תהליכים משלימים של עיבוד הרנ"א שליח לאחר השעתוק בתא היצרן תרגום יעיל ונכון של החלבון בתא היצרן קיום תהליכי עיבוד סופי של החלבון בתא היצרן 58

שילוב "גן מדווח" בנשא שידווח על על הצלחת הטרנספקציה בתאים העשרה שילוב "גן מדווח" בנשא שידווח על על הצלחת הטרנספקציה בתאים חברה מסחרית פיתחה ריאגנט מיוחד לטרנספקציה של תאי עצב ,הנקרא : NeuroPORTER Transfection Reagent זהו ליפיד קטיוני המתאים במיוחד להגברת יעילות החדרת גנים לתרבית ראשונית של תאי עצב. במטרה להוכיח ללקוח את יעילות הריאגנט בהחדרת גן ע"י הנשא , הם שילבו גן מדווח המקודד עבור תוצר פלואורסצנטי ( גן GEP ) . תאים שקלטו את הנשא עם גן המטרה יקלטו גם את הגן המדווח ויאירו בירוק זוהר. GEP : green fluorescent protein גן שמקורו ביצורי ים ( Jelly Fish ) מקודד לחלבון פלואורסצנטי ירוק כאשר מאירים אותו בקרני UV. משמש בביוכימיה (חקר חלבונים) ובביולוגיה מולקולארית - בהנדסה גנטית כגן מדווח ( reporter gene ) ובחקר הביולוגיה. http://www.genlantis.com/catalog/product_line.cfm?product_family_key=1&product_line_key=24 59

המתפתחים לעכברים ירוקים העשרה שימושים בגן מדווח GEP עכברי טרנסגניים המתפתחים לעכברים ירוקים בע"ח פלואורסצנטים הגן המוחדר בשלב הביצית המופרית יתבטא בכל התאים של כל הרקמות http://www.bms.ed.ac.uk/services/staff/jmason/Research.html http://crossings.tcd.ie/gallery/Kac/Eighth_Day/ http://userpages.umbc.edu/~jili/ench772/greenmice.html 60

חיידקי קולי שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד נושא גן מדווח GEP העשרה חיידקי קולי שעברו טרנספורמציה עם פלסמיד נושא גן מדווח GEP http://www.uccs.edu/~rmelamed/MicroFall2002/Chapter%208/ch%208.htm 61

תחומי השימוש בהחדרת גנים לתאי בע"ח ואדם 4 3 2 1 יצור בע"ח טרנסגנים ריפוי גני של מחלות תורשתיות ייצור- יתר מסחרי של תוצרים מחקר ( אפיון גנים ) 62

ייצור-יתר בקנה מידה מסחרי של תוצרים בתרבית תאים ייצור-יתר בקנה מידה מסחרי של תוצרים בתרבית תאים 2 יצור תוצר פעיל ויעיל יותר בתרבית של בע"ח דורש : קיום תהליכי עיבוד משלימים לאחר התרגום בריבוזומים. קיפול נכון של החלבון בתא הודות לסביבה ציטופלסמית מתאימה . יצירת קשרי גופרית נכונים ויצירת מבנה תלת-ממדי פעיל ביולוגית האפשרות לייצור מוגבר בתאי בע"ח ,עפ"י יכולת הפלסמיד להרבות את עצמו , בתא בע"ח ( ללא הצורך בהשתלבותו בגנום וללא תלות בשכפול התא). ( לכן, ע"י הצמדה לפלסמיד חיידקי המרבה את עצמו בקצב מוגבר או ע"י החדרה של רצף מגביר שעתוק או רצף בקרה חיובית בוקטור או בדנ"א עצמו, ניתן לקבל תא מהונדס שהוא יצרן-יתר) . רוב התוצרים המיוצרים בתרבית תאי בע"ח הם חלבונים בעלי תוספות (דורשים עיבוד משלים) : אינטרפרון - גליקופרוטאין , חלבון הנושא תוספת שייר סוכרי גורם הקרישה - חלבון הנושא תוספת של קבוצה קרבוקסילית וקבוצה הידרוקסילית * התוספות מתווספות לאחר התרגום ויצירת שרשרת החלבון בריבוזומים. האנזימים המבצעים עיבוד משלים מצויים גם בתאי בע"ח הגדלים בתרבית. ייצור מטבוליט ראשוני נעשה במערכת ייצור חד-שלבית ( שלב הייצור חופף לשלב הגידול) ורצוי לצרף לוקטור רצף מגביר שעתוק לפני הגן ( לא דורש אינדוקציה, פועל קבוע ) . ייצור מטבוליט שניוני (משני) נעשה במערכת ייצור דו-שלבית ( שלב הייצור מופרד משלב הגידול ) ורצוי לצרף לוקטור רצף בקרה חיובי לפני הגן ( מופעל ע"י אינדוקציה רק בתום שלב הגידול ). 63

ייצור חלבונים מרפאים בתאים של בע"ח מהונדסים ע"י וקטור נגיפי נושא גן http://www.nettally.com/prusty/gene.htm 64

ריפוי גני של מחלות תורשתיות 3 קיימות למעלה מ 4000 מחלות גנטיות תורשתיות הרעיון להחדיר גן תקין לתאי רקמה פגומה ( תוך התעלמות מהגן הפגום ) החדרת הגן התקין תעשה לתאי הגוף (תאים סומאטיים) . החדרת גן תקין לתאי המין או לתאים עובריים בעייתית (כי תיקון זה עובר בתורשה לצאצאים) התיקון אפשרי ויישומי רק לגבי מחלות של גן יחיד ( הפגם נקודתי בגן בודד) התיקון אפשרי במקרים של חוסר מוחלט בחלבון או בייצור כמותי מופחת . התיקון לא אפשרי כשיש מחלה של קבוצת גנים או כשיש מחסור בכרומוזום שלם התיקון לא אפשרי כשיש ייצור-יתר או ייצור חלבון הרסני של תוצר הגן שיטות ההחדרה של "הגן המרפא" חייבות : להבטיח שילוב של הגן בכרומוזום תא המטרה להבטיח ביטוי יציב ובקרת שעתוק ותרגום של הגן המושתל להבטיח העתקת הגן במהלך חלוקת התא יחד עם כרומוזום התא לבחור בתא המתאים ליצירת חלבון מעובד סופי ופעיל לבחור בנשא או בוקטור המתאים להחדרה לרקמה הספציפית http://peer.tamu.edu/curriculum_modules/Cell_Biology/module_4/whyitmatters.htm 65

משמעות התהליכים: החדרת הגן לתאי הגוף , החדרת גן לתאי המין , וריפוי גני הגן נמצא אצלי רק בתאים אליהם הוחדר ולא בכל גופי ולכן לא יעבור לצאצאי בתורשה. הזרקה לתאי הגוף (סומאטיים) הגן נמצא אצלי בכל התאים של כל הרקמות וגם בתאי המין שלי ולכן יעבור גם לצאצאי בתורשה כל התאים שלי טרנסגנים הזרקה לביצית מופרית גן תקין הגן הפגום עדיין אצלי אך לא פועל. הגן התקין נמצא אצלי רק בתאי הרקמה אליה הוחדר לצורך תיקון ולא יעבור לצאצאי בתורשה. ריפוי גני סומאטי 66

שימוש ב רטרו וירוס – עיקרון החדרת גן מרפא לתא מטרה מעטפת חלבונית פנימית מסביב לליבה (קפסיד) זיזים חלבוניים של המעטפת החיצונית יותר מהם נגיפי רטרו ? נגיפי רטרו, הם נגיפי סרטן , המכילים גנום שהוא חומצת גרעין RNA ,חד-גדילי, בתוך ליבה חלבונית המכילה גם אנזים המתעתק לאחור ( RT ). אנזים זה, הוא דנ"א פולימרז, המשתמש בתבנית רנ"א חד- גדילי כדי לבנות דנ"א . נוצר סליל של היבריד רנ"א-דנ"א . הליבה , שהיא נוקליאופרוטאין , ארוזה ועטופה מסביב במעטפת חיצונית, חלבונית.מהמעטפת החיצונית יוצאים זיזים חלבוניים המשמשים לספיחת הנגיף לתאים חיים. השלבים בחדירת הנגיף לתא המטרה : הנגיף הוא פרזיט תוך-תאי. גדל ומתרבה רק בתוך תא חי. 1. המעטפת החיצונית, מצוידת בזיזים ,נקשרת באמצעותם לאתרים מיוחדים (קולטנים), שעל קרום תא המטרה המודבק.זהו שלב הספיחה. 2. לאחר הספיחה לקרום התא, המעטפה נשארת מחוץ לתא , והליבה , שהיא נוקליאופרוטאין מוזרקת פנימה לציטופלסמה של התא המודבק. 3. חומצת הגרעין ( RNA ) של הנגיף מועתקת ל DNA ע"י האנזים הנגיפי המתעתק לאחור. 4. אנזים אחר תאי, דנ"א פולימרז , הופך את סליל הדנ"א לדנ"א דו-גדילי . 5. הדנ"א הנגיפי , במצב דו-סלילי, חודר לגרעין ומשתלב בדנ"א התאי. גנום הנגיף מוכפל במהלך התחלקות התא ועובר תעתוק ותרגום ליצירת חלבוני הנגיף. 6. מולקולות של גנום הנגיף נארזות ונעטפות בחלבוני מעטפת הנגיף ליצירת נגיפים בשלים בעלי יכולת יציאה מהתא ויכולת הדבקת תאים שכנים. 7. יציאת הנגיפים הבשלים מהתא נעשית ע"י הנצה דרך קרום התא המודבק. אנזים נגיפי RT בתוך הליבה רנ"א גנומי נגיפי בתוך הליבה מבנה נגיף רטרו 67

איור : מחזור חייו של נגיף רטרו בתא בע"ח http://www.bham.ac.uk/ChemEng/actg/actgres.htm נגיף רטרו בשל הסבר לאיור : הנגיף מדביק תא חי של בע"ח . בעזרת זיזים חיצוניים הוא נספח לרצפטורים על קרום התא. הוא מחדיר את הליבה לציטופלסמה של התא המודבק ויוצר עותק דנ"א של ה רנ"א הגנומי שלו ע"י האנזים RT . הדנ"א הופך לדו-גדילי , ע"י אנזים תאי , חודר לגרעין התא, ועובר אינטגרציה לגנום התאי. הגנים הנגיפיים עוברים תעתוק (טרנסקריפציה) בגרעין . בציטופלסמה מתקיים תרגום ( טרנסלציה) לחלבוני הנגיף. מתקיימת התארגנות עצמית (אסמבלי ). חלבוני הנגיף עוטפים את חומצת הגרעין הנגיפית ויוצרים מעטפת. הנגיף הבשל מניץ מתוך קרום התא החוצה. 68

נגיף וקטור-מרפא מדביק תא מטרה ע"י התקשרות לקולטנים ספציפיים על התא העשרה נגיף וקטור-מרפא מדביק תא מטרה ע"י התקשרות לקולטנים ספציפיים על התא http://ghr.nlm.nih.gov/ghr/picture/gene_therapy 69

הנדסת נגיף רטרו לשימוש בריפוי גני של בני אדם בניית פרו ווירוס מרפא : הוצאת גנים רעים מהנגיף ( גנים האחרים על יצירת חלבוני מעטפת הנגיף ) אך שומרים על סיגנל יכולת ההתעטפות של הנגיף ( סיגנל פסי + ) והכנסת הגן המרפא במקומם בתוספת רצף מגביר תעתוק לפני הגן = מתקבל פרו ווירוס מרפא ( נושא גן מרפא ) 2. אריזת חלקיקי הנגיף והבשלתם לוקטור מרפא בטוח : החדרת הפרו ווירוס מרפא לתא אריזה ,שהוא תא ביניים שבו הווירוס יבשיל . הנגיף יתעטף בחלבוני מעטפת לא שלו ( של ווירוס אחר מסייע) ויהיה בשל להדביק תאים . הפרו ווירוס המרפא מוחדר ביחד עם פרו ווירוס אחר, פרו ווירוס מסייע (לא מרפא ). הווירוס המסייע עבר קודם שינוי גני ע"י הוצאת סיגנל ההתעטפות ממנו ( הסיגנל נעדר ולכן הוא פסי - ) אך שמרו על יכולתו לייצר חלבוני המעטפת לצורך אריזה ( אם כי הוא עצמו מנוע מלהשתמש בהם ) הגנום של שני הפרו ווירוסים עובר אינטגרציה בכרומוזום תא האריזה. הגנום מועתק בתא האריזה . גנום הפרו ווירוס המסייע מייצר חלבוני אריזה אך לא יכול לעטוף את עצמו בהם. הפרו ווירוס המרפא, שאין ביכולתו לייצר חלבוני אריזה, משתמש בחלבונים של הפרו ווירוס האחר כדי לארוז את עצמו ולהבשיל לווירוס אינפיקטיבי וליציאה מהתא = מתקבל וירוס בשל שהוא " וקטור בטוח " 3. הדבקת תא המטרה להחדרת הגן המרפא: חלקיקי הנגיף הבשל יוצאים בהנצה מתא האריזה ועוברים להדביק את תאי המטרה המיועדים לריפוי בעזרת המעטפת החלבונית הם נספחים לקרום תאי המטרה ומזריקים את הליבה לציטופלסמה רנ"א הנגיף הופך לעותק דנ"א ע"י האנזים הנגיפי RT ואח"כ לדנ"א דו-גדילי ע"י דנ"א פולימרז תאי גנום הנגיף עובר אינטגרציה בכרומוזום התא . הנגיף אינו יכול להתרבות מחוסר חלבוני מעטפת הגן המרפא בעזרת רצף מגביר שעתוק המחובר אליו לפני הגן עובר תעתוק ןתרגום לחלבון מרפא 70

יתרונות וחסרונות השימוש בנגיפי רטרו בריפוי גני מגבלות וקשיים : האינטגרציה בכרומוזום תא המטרה מתקיימת רק בתאים מתחלקים (מתרבים) מקום השתלבות גנום הנגיף בכרומוזום אקראי ועלול להיות באמצע גן חיוני ולבטל בכך את ביטויו . יש סכנה להתמרה סרטנית אם הנגיף ישתלב באתר הקרוב לאתר פרו-אונקוגני (בעל פוטנציאל ליצירת סרטן) יתרונות השימוש בנגיפי רטרו : מדביקים טבעית תאי מאחסן ומצוידים במנגנון טבעי להחדרת הגנום לתוך התא מבטיחים השתלבות הגן המרפא בכרומוזום התאי, הודות לאנזים RT קל להוציא מהם גנים מזיקים ( הגן ליצירת חלבון המעטפת ) ולהבטיח בכך, יצירת וקטור (נשא) בטוח לריפוי גני. קל לבטל את יכולת הריבוי שלו בתא המטרה המיועד לריפוי הגני . 71

סיכום של סוגי וקטורים המשמשים בריפוי גני העשרה 72 http://www.york.ac.uk/depts/biol/units/cru/gendeliv.htm

דרכי החדרת הגן לתא בע"ח ע"י נשאים שונים העשרה 73 http://www.hosppract.com/genetics/9910mmc.htm

שיטת הריפוי הגני בתרבית תאים ( ex-vivo ) שיטת טיפול מקובלת היום : מוציאים תאים ספציפיים של רקמה חולה, מהחולה מגדלים ומרבים אותם מחוץ לגוף. יוצרים תרבית תאים . מחדירים בעזרת נגיף רטרו – נשא את הגן המרפא לתאים בתרבית (הריפוי מתבצע בתאי החולה עצמו מחוץ לגוף – ex-vivo ) התאים המתוקנים, מוחזרים לגוף החולה ומבטאים חלבון שחסר או חלבון תקין ( במקום החלבון הפגום ). התנאים להצלחת השיטה : תאים חזקים יציבים,שניתן לגדלם מחוץ לגוף , בתרבית. תאים נגישים , קל להוציאם מהגוף וקל להחזירם . תאים בעלי טווח חיים ארוך בגוף כדי שהטיפול יהיה יעיל לזמן רב. תאים חדירים לנגיף- נשא של הגן המרפא התאים המתאימים לדרישות הנ"ל הם : תאי עור – דרמיס (פיברובלסטים) תאי מח העצם ( תאי גזע ) לימפוציטים ( תאי דם ) תאי כבד 74

עיקרון שיטת הריפוי הגני באדם ( ex vivo ) 3. האנזים RT הופך את ה רנ"א הנגיפי לדנ"א המשתלב בדנ"א של התא ומתקבל תא רקומביננטי 4. מחזירים לגוף את התאים המתוקנים 2. בעזרת נגיף רטרו מחדירים גן תקין לתאים 1. מוציאים מהגוף תאים שהגן בהם פגום http://www.themronline.com/200412m2.html http://www.themronline.com/dec04-19.jpg 75

תרבית משתלי עור : דוגמה לתאים המתאימים לשימוש בריפוי גני בתחום יישום של ההנדסה הגנטית והריפוי הגני משתמשים בשתלי עור ( פיברובלסטים ) להחדרת גנים תקינים, כתחליף לרקמה הטבעית המייצרת את תוצר הגן. שלבי השיטה : מגדלים תאי עור ( פיברובלסטים של הדרמיס ) בתרבית מחדירים לתאים בתרבית גן מרפא בעזרת נגיף רטרו משבצים אותם בתוך ג'ל של קולגן ושותלים את השתל בדרמיס עור של החולה . השתל נקלט ומתמלא בנימי דם . 5. הפיברובלסטים המהונדסים מייצרים ומפרישים לדם את התוצר המרפא הסיבה לשימוש בתאי העור לריפוי גני : הם חיצוניים ונגישים קל להוציאם וקל להחזירם לגוף הם תאים חזקים ועמידים בתרבית מחוץ לגוף הם חדירים לנגיף-נשא הגן המרפא מתרבים במהירות ובכמויות בתרבית מחוץ לגוף יש להם יכולת להפריש חומרים מחוץ לתא למחזור הדם המטרה להשתמש במשתלי עור מהונדסים לייצור חלבונים מרפאים בגוף כתחליף לרקמה המקורית (בעלת הגן הפגום ) , האמורה לייצר באופן טבעי את החלבון. ההנחה היא, שמחזור הדם יעביר את החלבון המופרש משתל העור לרקמות הזקוקות לו. 76

פיברובלסטים מהונדסים המשמשים בריפוי גני גדלים במצע ג'ל קולגן פיברובלסטים מהונדסים המשמשים בריפוי גני גדלים במצע ג'ל קולגן העשרה חשיבות הקולגן בתרבית תאים ראשונית : הקולגן מספק רקמה תומכת לתאים המחברת בין התאים המתפתחים בתרבית. הקולגן מעודד התרבות והתמיינות של התאים בתרבית הקולגן מעודד ספיחת התאים ומאריך את משך חיי התרבית http://www.biologicalprocedures.com/bpo/arts/1/72/m72f1lg.htm 77

מחלות תורשתיות המתאימות לטיפול ע"י ריפוי הגני התנאים להצלחת השיטה של הריפוי הגני : המחלה התורשתית נובעת מפגם בגן יחיד בודד בלבד. הפגם הוא היעדר מוחלט או ייצור מועט של החלבון ( מחלות חסר ) אם הפגם הוא ייצור-יתר ( מחלות עודף ) או ייצור חלבון הרסני אין משתמשים בשיטה זו. יש נשא מתאים להחדרת הגן לסוג התאים הספציפי המעורב במחלה. דוגמאות למחלות תורשתיות המתאימות לריפוי גני היפר כולסטרמיה תלסמיה המופיליה סיסטיק פיברוזיס הפגם : חסר חלבון המשמש קולטן לליפופרוטאין מסוים התוצאה: הצטברות כולסטרול ושומנים בדם. המחלה: סתימת כלי דם בגיל צעיר. הפגם : חסר חלבון האחראי לבניית ההמוגלובין שבדם. התוצאה: בעיות בהובלת חמצן לרקמות הגוף . המחלה: אנמיה חמורה ( חוסר דם ) הפגם : חסר חלבון (חלבונים) האחראי לקרישת הדם. התוצאה: דימום לאחר פציעה ללא אפשרות קרישה . המחלה: איבוד דם בפציעות רב. הפגם : חסר חלבון האחראי למעבר יוני הכלוריד דרך קרום תאי האפיתל של הריאות. התוצאה: הצטברות ריר בסמפונות ובריאות המחלה: דלקות ריאות חוזרות וקשיי נשימה. 78

דוגמה לשימוש בריפוי גני של סיסטיק פיברוזיס ( CF ) העשרה דוגמה לשימוש בריפוי גני של סיסטיק פיברוזיס ( CF ) סיסטיק פיברוזיס : זו מחלה תורשתית של גן אחד יש פגם גנטי בתפקוד תאי אפיתל של הריאות הפגם : מחסור בייצור חלבון - נשא בקרום האחראי על הכנסת יוני הכלוריד לתאים הנזק : הצטברות ריר סמיך בסמפונות ובריאות הגורם לדלקת ולחוסר נשימה סכנת מוות תדירות המחלה : 1:2500 ניסויים בריפוי גני של CF בעזרת נגיף ( השתמשו בנגיף אדנו ) 79 http://www.hosppract.com/genetics/9910mmc.htm

טיפול במחלת ADA-SCID ע"י ריפוי גני של תאי גזע ממוח העצם העשרה טיפול במחלת ADA-SCID ע"י ריפוי גני של תאי גזע ממוח העצם המחלה SCID: מחלה תורשתית של מערכת החיסון הפגם במח העצם בדם ההיקפי, יש חסר בלימפוציטים מסוג T , הגורר אי תפקוד של לימפוציטים מסוג B . החסר מתבטא באי יכולת הגוף לפתח תגובה חיסונית נגד זיהום מיקרוביאלי . המחלה נקראת "מחלת כשל חיסוני חמור מורכב" - כי יש פגיעה בתפקוד סוגים שונים של תאי הדם הלבנים . Complex Immuno Deficiency = SCID ) Severe ) מחלת SCID-ADA ( אחד מסוגי המחלה) הפגם בגנוטיפ: מוטציה בגן המקודד ליצירת האנזים ADA בתאי הגזע (תאי מוצא) , שמהם נוצרים לימפוציטים T . אין פעילות של אנזים ADA הפנוטיפ: מחסור באנזים ADA תקין בתאי-הגזע (תאי מוצא) של לימפוציטים מסוג T, הגורם למותם במח העצם. מחסור בתאי גזע תקינים במח העצם. מחסור בלימפוציטים T בדם ההיקפי ובעקבות זאת יש כשל חמור של מערכת החיסון העלול לגרום למוות. הביוכימיה של המחלה SCID-ADA : האנזים ADA ( Adenosine De Aminase) מונע הצטברות רעילה של אדנוזין, בתוך תאי הגזע במוח העצם, ע"י פירוקו ושחרור קבוצה אמינית ממולקולת האדנוזין (דאמינציה) . אם האנזים פגום ,מצטבר אדנוזין בתאים בכמות רעילה הגורמת למות תאי הגזע של לימפוציטים T . 80

החדרת גן מרפא לתאי מח העצם - דוגמה לריפוי גני של מערכת החיסון החדרת גן מרפא לתאי מח העצם - דוגמה לריפוי גני של מערכת החיסון העשרה 6. לאחר שבועיים מערכת החיסון מגינה מפני זיהומים 1. מוציאים תאי מח עצם מהתינוק 5. מחזירים את התאים המתוקנים לגוף התינוק 2. ריבוי וגידול התאים בתרבית וברירה של תאי חיסון 4. בוררים את התאים המכילים גן מתקן 3. מדביקים את התאים בנגיף נושא גן מתקן http://www.jeansforgenes.com/2_about/2070_howitworks.php 81

ייצור זנים טרנסגנים של בע"ח 4 עיקרון ייצור בע"ח טרנסגני : מחדירים את גן המטרה ישירות לגרעין תא ביצית מופרית (או בשלב עובר) ע"י מיקרוהזרקה. הגן משתלב בגנום התאי . מאפיינים ויתרונות השימוש בבע"ח טרנסגנים : גן המטרה מתבטא בכל התאים של כל הרקמות בבע"ח (הגן הוחדר בשלב ביצית מופרית). הביטוי יציב לכל משך חייו . הגן עובר בתורשה מדור לדור לצאצאים . ( יתרון ) תוצר הגן מיוצר בנפחים גדולים בבע"ח ביו-ריאקטורים ( בע"ח טרנסגנים, המשמשים יצרנים של תוצר מסחרי ), בהשוואה לתרבית תאים ( יתרון ) . עלות הייצור בבע"ח טרנסגני זולה יותר בהשוואה לתרבית תאים ( יתרון ) סרטון של ייצור בע"ח טרנסגני המפריש חלבון אדם ( בחלב ) http://www.learner.org/channel/courses/biology/archive/animations/hires/a_gmo3_h.html 82

עיקרון הכנת בע"ח טרנסגני עיקרון הכנת בע"ח טרנסגני בידוד גן אדם בידוד ביצית מעז והפרייתה מיקרו הזרקה של גן האדם לביצית המופרית השתלה בעז אם פונדקאית ולד עז טרנסגנית חלב עז מכיל חלבון אדם. מבודדים מהחלב את חלבון האדם http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072919345/student_view0/chapter16/elearning.html# 83

תחומי שימוש בבע"ח טרנסגנים : השבחת זנים / השבחת מוצרים מבע"ח בתחום החקלאות הקניית עמידות לבע"ח כנגד מחלות קצב גידול וריבוי מהיר יותר איכות צמר משופרת בכבשים דגים המתרבים מהר יותר ייצור בע"ח טרנסגנים ביו-ריאקטורים בתחום הרפואה עז המייצרת ומפרישה פלסמינוגן אקטיבטור של אדם בחלב פרה המייצרת ומפרישה לקטופרין של אדם בחלב אנימציה של יצירת בעל חיים טרנסגני http://www.learner.org/channel/courses/biology/archive/animations/hires/a_gmo3_h.html 84 http://www.unc.edu/~unclng/cow.jpg

אתיקה העשרה אתיקה http://www.shef.ac.uk/b/bioethics-today/Lancaster/animal/transgenic.htm אתיקה http://www.accessexcellence.com/RC/debates.html 85

העשרה 86 איחוי פרוטפלסטים http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-online/e29/29c.htm אמצעים לשיפור טרנספקציה http://www.bmb.psu.edu/courses/biotc489/notes/transform.htm ריפוי גני http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/genetherapy.shtml http://ghr.nlm.nih.gov/ghr/picture/gene_therapy http://biology.kenyon.edu/slonc/gene-web/Lentiviral/Lentivi2.html http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/PackagingCell.gif http://stemcells.nih.gov/info/scireport/chapter11.asp http://www.jeansforgenes.com/2_about/2070_howitworks.php http://www.york.ac.uk/depts/biol/units/cru/gendeliv.htm http://faculty.uca.edu/~johnc/biotec1440.htm מחלות תורשתיות המטופלות בריפוי גני http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/G/GeneTherapy.html מחלת SCID - ADA http://dragon.zoo.utoronto.ca/~jlm2001/J01T0601B2/MainText.html שימוש בנגיף רטרו לריפוי גני של מחלת ADA http://dragon.zoo.utoronto.ca/~jlm2001/J01T0701E/retrovirus.html ריפוי גני של סיסטיק פיברוזיס http://ehp.niehs.nih.gov/docs/2001/109-1/forum.html http://www.hosppract.com/genetics/9910mmc.htm 86

אנימציה של חדירת נגיף לתא בע"ח ריפוי גני http://www.amalnet.k12.il/meida/biolog/bioi0145.htm ריפוי גנים על שולחן הניתוחים http://www.snunit.k12.il/science/biology/a_gripui.html שיבושים גנטיים ותיקונם http://www1.snunit.k12.il/heb_journals/kimat2000/11-40.htm המהפכה הגנטית http://www1.snunit.k12.il/heb_journals/galileo/006012.html העשרה אנימציה של חדירת נגיף לתא בע"ח http://www.hhmi.org/biointeractive/animations/infection/inf_middle_frames.htm 87 http://www.bham.ac.uk/ChemEng/actg/actgres.htm

העשרה 88 מידע על חלבונים מרפאים : אינסולין http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Pancreas.html פקטורי קרישה - פקטור 8 , פקטור 9 http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/C/Clotting.html#Bleeding_disorders הורמון הגדילה http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/P/Pituitary.html#GH אריתרופואטין http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/K/KidneyHormones.html#epo מפעיל פלסמוגן http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/C/Clotting.html#tpa הפקת חומרי רפואה http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/R/RecombinantDNA.html#Some_recombinant_DNA_products_being_used_in_human_therapy 88

חיסון בדנ"א ע"י פלסמיד מחסן DNA Vaccine העשרה חיסון בדנ"א ע"י פלסמיד מחסן DNA Vaccine חיסון בדנ"א התפתח בעקבות ריפוי גני משתמשים בפלסמיד הנושא גן עבור חלבון אנטיגני , המוחדר לגוף כדי להשרות תגובה חיסונית ספציפית לחלבון המטרה שהגן מקודד עבורו . הוקטור : דנ"א פלסמידי הנושא גן + פרומוטור + רצף מגביר תעתוק ההזרקה In Vivo : תת-עורית או לתוך הדרמיס או לתוך השריר או ע"י תותח גנים יתרונות החיסון עם דנ"א : הפלסמיד יכול לקודד עבור יותר מאפיטופ אחד חיסון זה מעורר תגובה תאית חזקה וגם יצירת נוגדנים אפשר לייצר חיסון זה בצורה מסחרית החיסון לטווח ארוך אין סכנת זיהום בנגיפים חיסון לא יקר חסרונות : אינטגרציה בכרומוזום התא לא בשליטה סכנת יצירת נוגדנים כנגד הדנ"א סכנה לשינוי בבקרת התאים ופגיעה בהם סכנה להשרות סבילות חיסונית לאנטיגן לא יעיל באנטיגן לא חלבוני 89

איור עיקרון החיסון בדנ"א העשרה איור עיקרון החיסון בדנ"א 90

העשרה בע"ח טרנסגניים http://highered.mcgraw-hill.com/sites/0072919345/student_view0/chapter16/elearning.html http://www.mhhe.com/biosci/genbio/maderbiology7/student/olc/chap17-outline.mhtml http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html http://www.btgplc.com/about/Interferons.html http://www.avigenics.com/services.htm http://www.rbej.com/content/1/1/80/figure/F2 http://www.biotech.iastate.edu/biotech_info_series/bio10.html http://www.agresearch.co.nz/scied/search/biotech/gene_gmomaking_animal.htm הפקת פקטור 8 מבע"ח טרנסגני http://www.ext.vt.edu/pubs/biotech/443-003/443-003.html#L2 הסבר של השיטה http://www.cartage.org.lb/en/themes/Sciences/Zoology/AnimalPathology/TransgenicAnimals/TransgenicAnimals.htm 91

העשרה 92 שימושים והתועלת בבע"ח טרנסגניים לאדם http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/T/TransgenicAnimals.html http://www.actionbioscience.org/biotech/margawati.html http://www.ag.uiuc.edu/~vista/html_pubs/irspsm91/transfor.html 92