Universitätsklinik und Poliklinik für Gynäkologie MEDIZINISCHE FAKULTÄT UND KLINIKUM DER MARTIN-LUTHER-UNIVERSITÄT HALLE-WITTENBERG Die kooperative Wirkung von cAMP und TGFβ auf tumorrelevante Gene bei Brustkrebszellen Oerlecke, I., Bauer, E., Dittmer, A., Dittmer, J. TGFß Einleitung und Fragestellung 3D-Kultur 25-fache Vergrößerung Prostaglandin etc. Krebsentstehung und –progression sind Folge einer Fehlsteuerung der Genexpression. Die Genexpression kann durch eine Vielzahl von exogenen und endogenen Faktoren reguliert werden. Neben Wachstumsfaktoren nehmen auch die Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen Einfluss auf die Genregulation. Wir haben untersucht, inwieweit sich die Expression tumorrelevanter Gene nach Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels, unter Einwirkung von TGFβ sowie bei Zusammenwirken beider Stimuli verändert. Dazu wurde in herkömmlichen adhärenten 2D-Kulturen und in nicht-adhärenten 3D-Kulturen in MDA-MB-231 Brustkrebszellen gearbeitet. cAMP ? Genexpression Konventionelle Monolayerkultur (2D) 100-fache Vergrößerung Schema zu den Signalwegen von cAMP & TGFß Ergebnisse 3D 2D MDA-MB-231 Zellen wurden mit Forskolin zur Erhöhung des intrazellulären cAMP (cyclic adenosine mono-phosphate)-Spiegels und/oder mit TGF (transforming growth factor ) oder ohne Stimuli unter 2D oder unter 3D-Kulturbedingungen inkubiert. Die RNA-Level von tumorrelevanten Genen wie PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1), TIMP1 (tissue inhibitor of matrix metalloproteases), Integrin α6 und β1, Ets1, Cox-2 (cyclooxygenase-2), TGFβR1 (TGF receptor 1) u.a. wurden mittels qRT-PCR bestimmt. cT [cT– cT {(GAPDH + HPRT)/2} - cT(mock)] TGF/cAMP-Effekt in 2D Bei den Genen Ets1, ITGA6 und PAI-1 ist in der 2D-Kultur ein negativer cAMP- und positiver TGFβ-Effekt zu beobachten. Die mRNA der Gene Cox-2, TIMP1 und MMP-9 wird in der 2D-Kultur sowohl durch cAMP als auch durch TGFβ erhöht. Der resultierende Effekt durch beide Stimuli ist bei PAI-1, Cox-2 und TIMP1 höher als durch Addition der einzelnen Effekte zu erwarten ist. TGF/cAMP-Effekt in 3D Unter 3D-Bedingungen sind die Effekte gleichgerichtet, jedoch stärker als in der 2D-Kultur. Bei gleichzeitiger Gabe von cAMP und TGFß kann die Expression von PAI-1, Cox-2 und TIMP1 aber kaum noch stärker stimuliert werden als durch TGFß allein. Die Mengen an PAI-1 und TIMP1-Protein wurden im Zellkulturüberstand mittels Western Blot bestimmt. Unter 2D-Bedingungen stimmen sie mit der mRNA-Menge überein. Die in der 3D-Kultur nachgewiesenen mRNA- und Proteinmengen verhalten sich teilweise unterschiedlich. PAI-1 TIMP1 PAI-1 TIMP1 Genexpression 2D vs. 3D TGFβ-Rezeptor 1 In der 2D-Kultur wird durch Forskolingabe die Expression des TGFβ-Rezeptors 1 gesteigert. Dieser Effekt ist nur sehr schwach unter 3D-Bedingungen. 2D 3D cAMP-Level Unter 3D-Bedin- gungen wurden erhöhte basale cAMP-Konzen-trationen fest-gestellt, die den geringeren Forskolineffekt erklären könnten. Zusammenfassung Schlussfolgerungen cAMP und TGFβ regulieren tumorrelevante Gene in MDA-MB-231 Zellen cAMP/TGFβ-Effekte entsprechen oft nicht den additiven Einzeleffekten erhöhte cAMP-Spiegel führen zur Hochregulation des TGFβ-Rezeptor 1 cAMP- und TGFβ-Effekte gleichgerichtet, aber unterschiedlich stark unter 2D und 3D-Kulturbedingungen basale Genexpression in 3D und 2D sind häufig unterschiedlich cAMP und TGFβ-Signale werden in der Zelle miteinander gekoppelt synergistischer Effekt beider Stimuli resultiert vermutlich aus cAMP- vermittelter Hochregulation des TGFβ-Rezeptor 1 und damit verstärkter TGFβ-Wirkung veränderte Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kontakte durch Wahl der Kulturbedingungen verschieben den basalen cAMP-Spiegel und damit die Stärke der Genexpression tumorrelevanter Gene