Bestimmung der Molaren Masse von Grün fluoreszierendes Protein (GFP)

Polyacrylamid- Gelelektrophorese (PAGE) Bestimmung der Molaren Masse von Grün fluoreszierendes Protein (GFP)

1. Ansetzen der Proben für die Polyacrylamid-Gelektrophorese (PAGE) Aufgabe 1: Überprüfen Sie Ihr Probentube (P) im UV-Feld auf Grünfluoreszenz!

1. Ansetzen der Proben für die PAGE 1.1 Pipettieren Sie 10 µl Lämmli-Puffer in Ihr Probentube (P). 1.2Durchmischen Sie Ihr Probentube (P) durch Anschnippen.

2. Vorbereiten der Gelkassette 2.1 Schneiden Sie die Verpackung des Fertiggels entlang der vorgegebenen Linie auf und entnehmen Sie die Gelkassette.

2.2Schneiden Sie mit einem Skalpell die Klebefolie der Gelkassette entlang der markierten unteren Linie ein und ziehen Sie den unteren Streifen ab. 2. Vorbereiten der Gelkassette

3.1 Setzen Sie die Gelkassette mit der kürzeren Platte nach innen gerichtet in den Elektrodenstand ein. Setzen Sie auf der gegenüberliegenden Seite eine weitere Gelkassette oder eine Blindplatte ein. 3.2 Drücken Sie den Elektrodenstand im Klammer- rahmen nach unten und schließen Sie die zwei Klemmklappen. 3.3Setzen Sie den Klammerrahmen mit dem Elektrodenstand in den Pufferbehälter ein. 3.4Ziehen Sie den Kamm. (Einkerbung beachten!) 3. Vorbereiten der Elektrophorese- kammer

4.1Befüllen Sie den Elektrodenstand mit TGS-Puffer bis zum oberen Rand. 4.2Befüllen Sie den Pufferbehälter mit etwa 200 ml TGS-Puffer. 4. Befüllen der Kammer mit Puffer

Kaleidoskop- standard Probe 5. Befüllen der Geltaschen (Rechte und linke Geltasche des Fertiggels bleiben leer!) Befüllen Sie die Geltaschen mit: - 15 µl Kaleidoskop- Längenstandard (K) - 15 µl aus Probentube (P)

6.1Schließen Sie die Gelkammer und starten Sie die Gelelektrophorese bei 200 V. 6.2Die Elektrophorese wird beendet, wenn das Bromphenolblau den unteren Rand des Gels erreicht hat. 6. Durchführung der Elektrophorese

7.1Entnehmen Sie den Klammerrahmen aus dem Pufferbehälter und dekantieren Sie den Puffer in den Pufferbehälter ab. (Puffer ist wieder verwendbar) 7.2Entnehmen Sie die Gelkassette aus dem Elektrodenstand. 7. Entnahme des Gels

8. Auswertung 8.1Markieren Sie die GFP-Bande im UV- Feld.

FarbekDa Blau250 kDa Violett150 kDa Blau100 kDa Magenta75 kDa Blau50 kDa Grün37 kDa Magenta25 kDa Blau20 kDa Blau15 kDa Gelb10 kDa Tab.: Molare Masse der Proteine im Kaleidoskop-Standard 8. Auswertung 8.2Ermitteln Sie die Molare Masse von GFP anhand des Kaleidoskop-Standards