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Sandro Rusconi (9.3.52) a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Sportdoping mittels Gentransfer: relistisch oder nur virtuell? Winterthur 01.06.2006 28. W'thurer.

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1 Sandro Rusconi (9.3.52) a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Sportdoping mittels Gentransfer: relistisch oder nur virtuell? Winterthur W'thurer Fortbildunkgskurs Primarschullehrer (Locarno, Switzerland) Diploma in Molekularbiologie UNI Zuerich PhD curriculum UNI Zuerich, molecular biology Oberassistent UNI Zuerich Postdoc UCSF, K Yamamoto, (San Francisco) Group leader, UNI Zuerich, PD oggiOrdentliche professor Biochemie UNI Fribourg Direktor Swiss National Research Program 37 'Somatic Gene Therapy' Sabbatical, Tufts Med. School Boston and Univ. Milano, Pharmacology Department Präsident Union of Swiss Societies for Experimental Biology (USGEB) Euregenethy Network (EU-harmonsiation of biosafety and ethical aspects in gene therapy) Direktor Divisione Cultura e Studi Universitari Cantone Ticino

2 Wo stehen wir mit Gentherapie? Erfolge und Misserfolge einer 15-jährigen Geschichte Welche konkrete Möglichkeiten gäbe es fuer Gendoping? Praktische Perspektiven, Hürde, Detektionsmöglichkeiten, Nebeneffekte, Risiko-Nutzen Bilanz Wieso ist Gentransfer attraktiv für den Doping? Erwartungen insbezug auf Leistung und Tarnung Aspekte die behandelt werden a aa a aa Ziele und methoden der Therapie mittels Gentransfer ('Gentherapie') Gene, Prinzipien, Vektoren, Methoden Schlussfolgerungen Gendoping ist noch im sehr unreifem Zustand, trotzdem bewegt sich jemand in dieser Richtung UNIFR Rusconi 2006 Quintessenz Lesen sie vor allem im diesen orange Box

3 Abschnitt 1: Konzepte a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Gewebe, Zellen, Genen Genfunktion, Genmanipulation Was ist eigentlich einen Gen? Was man sich vorstellt und was realisierbar ist mit Dentransfer

4 1 Organismus -> Zellen (10'000'000'000'000!!!), in spezialisierten Gewebe und Organe a aa a aa 2m 2 mm0.2mm 0.02mm DNA RNAProtein 0.001mm Ergo in 1 cm 3 -> 1'000'000'000 Zellen um Gentransfer zu erzielen muss man neue DNA Molekuele in den Zellkerne dieser Zellen einschleusen UNIFR Rusconi 2006

5 Das Motto: 'ein Gen = eine Funktion' ist definitiv veraltet a aa a aa RNA(s) DNA GENE Protein(s) 2-5 FUNCTIONS Gene expression Transcription / translation Ergo: die Nebeneffekte eines Gentransfers koennten viel weiter gehen als man sich von den bekannten Funktionen sich vorstellen darf UNIFR Rusconi 2006

6 Aber, was ist eigentlich ein Gen?: ein Segment von Erbinformation die durch eine Nanomachine interpretiert wird a aa a aa RNADNAProtein GENEFUNCTION Transcription / translation codingspacer regulatory DNA RNA UNIFR Rusconi 2006 Um die Rolle zu leisten, muss einen DNA Segment folgende Signale beinhalten RNA Transkription (qualitativ und quantitativ) RNA Maturatuion RNA Translation (Uebersetzung in eiweisse) RNA Abbau Dilemma: wie kann man alles in einem verkuerzten DNA Stück einpacken?

7 Was man sich vorstellt und was ist eigentlich machbar im Bereich humaner Gentransfer? a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 gesellschaftliches Mythos der Gentechnik Genmanipulationen werden die Schaffung von gezielt konstruierte transgene Monster-Armeen erlauben Realität Die Schaffung transgene Menschen (mit erbbaren, artifiziellen Genveränderungen) steht noch weit Man 'begnügt' sich mit somatischem Gentransfer (nicht permanent und nicht erbbar) Ergo das gilt auch für Gendoping. Fuer die Nächste Jahren müssen wir keine transgene Athleten erwarten. Aber somatisch veränderte Sportler sind wohl im Bereich des Machbares.

8 Abschnitt 2: Somatische Gentherapie (SGT) a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Definition und Anwendungen Unterschiede zur konventionellen Therapie Wieso 'somatisch'? Anatomische Gentransfer-Wege

9 Somatische Gentherapie (SGT): Definitionen und Anwendungen a aa a aa efinition von SGT: 'Gene als Medikamente anwenden': Behandlung von Krankheiten mittels Gentransfer Chronische Behandlung Akute Behandlung Vorbeugende Behandlung Erbkrankheiten Erworbene Krankheiten Loss-of-function Gain-of-function NFP37 somatic gene therapy UNIFR Rusconi 2006

10 Pharmakologische Betrachtungen des DNA Transfers a aa a aa OH OH O OH OH O O OH OH O O Mw Daltons Synthetically prepared Rapid diffusion/action Oral delivery possible Cellular delivery: - act at cell surface - permeate cell membrane - imported through channels Can be delivered as soluble molecules Ångstrom/nm size rapidly reversible treatment Konventionelle Medikamente Mw Da Biologically prepared Slower diffusion/action Oral delivery not possible Cellular delivery: - act extracellularly Can be delivered as soluble molecules nm size rapidly reversible treatment Protein Medikamente Mw N x Da Biologically prepared Slow diffusion Oral delivery inconceivable Cellular delivery: - no membrane translocation - no nuclear translocation - no biological import Must be delivered as complex carrier particles nm size slowly or not reversible DNA als Medikament Therapie mittels DNA braucht spezielle formulierung des Materials (Vektoren) ist viel komplizierter als konventionelle verabreichung ist viel weniger reversibel als konventionelle pharmakologische Therapie UNIFR Rusconi 2006

11 a aa a aa UNIFR Rusconi 2003 Keimzellen: die Zellen die für die Vermehrung des Organismus notwendig sind Solmatische Zellen: alle andere Zellen des Körpers Ergo: somatische Gentherapie berürht die Keimzellen NICHT Die Veränderung ist nicht erbbar Wieso 'somatisch ' ? UNIFR Rusconi 2006

12 Die drei anatomische Hauptwege fuer den Gentransfer: a aa a aa Ex-vivoIn-vivo lokale Verabreichung In-vivo systemische Verab. V Beispiele: - Knochenmark - LeberZellen - HautZellen Beispiele: - Gehirn - Muskeln - Auge - Gelenke - Tumoren Beispiele: - Intravenös - intra-arteriell - intra-peritoneal UNIFR Rusconi 2006 Ergo die ex-vivo und die lokale in-vivo Routen sind heute bevorzugt

13 Abschnitt 3: Vektoren für Gentransfer a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Die zwei Klassen: viral und nicht-viral Beispiele der Unterschiede Mini-liste der gängigen Vektoren Limitierungen der gängigen Vektoren

14 Zwei Klassen von SGT Vektoren: Viral bzw Nicht-Viral a aa a aa A B non viral gene transfer (transfection) viral gene transfer (Infection) Nuclear envelope barrier! direct nuclear shuttling! UNIFR Rusconi 2006 Wieso sind Viren bessere Vektoren? viel effizienter! nicht virakle systeme haben folgende Hürde noch nicht überschritten: - Stabilität im Blut - Spezifisches Andocken - Vermeidung des intrazellulären Abbau - Transfer im Zellkern - Integration ins Wirtsgenom - Anti-apoptotische Funktionen - Tarnung gegenüber dem Immunsystem -...

15 Praktisches Beispiel: Transfer eines Reporter-Gens mit Transfektion (= nicht viral) oder Infektion (= Viral) a aa a aa Transfection Infection Zellen inkubiert mit 1'000'000 r-DNA/cell während 12 Stunden Zellen inkubiert mit 3 r-virus/cell während 30 min UNIFR Rusconi 2006 Ergo Gentransfer mit viralen vektoren ist millionenfach effizienter als nicht viraler Gentransfer

16 Mini-liste der gängigen Vektoren für Gentransfer a aa a aa r-Adenovirus r- Adeno-associated V. r- Retrovirus r- Lentivirus Naked DNA Liposomes & Co. Oligonucleotides RNAi UNIFR Rusconi 2006 Ergo aber erinnern wir daran: "nobody is perfect..."

17 Limitierungen der gängigen SGT Vektoren a aa a aa r-Adenovirus - no persistence - limited packaging - toxizität immunogenizität Biolistic bombardment or local direct injection - limited area Electroporation - limited organ access Liposomes, gene correction & Co. - rather inefficient transfer In generale - ineffizienter transfer - Seltene integration ins Wirtsgenom Solutions: - improved liposomes with viral properties (Virosomes) UNIFR Rusconi 2006 r-AAV - no integration in host g. - very limited packaging - autoimmunität? r-Retrovirus (incl. HIV) - limited packaging - zufälliger Insertion - unstable genome In generale - Immunantwort - limitierte Verpackungsraum - Stillegung der Expression - Ineffizienz der Produktion Solutions: - synthetic viruses (Virosomes) Ergo in die Zukunft werden synthetische Partikeln viele Virale Funktionen integrieren

18 Abschnitt 4: der langsame Fortschritt der Gentherapie a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Klinische Versuche der letzten 15 Jahren Erfolge und Meilensteine Dokumentierte Nebeneffekte

19 15 jahre Gentherapie in der Klinik a aa a aa cancer hered. Infect. vasc trials patients % overall still pending or not yet Initiated ! 66% phase I 19% phase I-II 13% phase II 0.8% phase II-III 1.7% phase III Januar 2006: 1030 cumulative protocols 5300 treated /enrolled patients Ergo Trotz intensiver Forschung hat weniger als 2% der SGT Versuche Phase III erreicht I I-II II UNIFR Rusconi 2006 Ausnahmen (China!) Jan :Gendicine, by Sibiono Inc. 2004, in Cina behandelte patienten in 2004, >50'000 in 2005? Nov :H101, by Shanghai Sunway biotech, in Cina. Unbekannte Angaben.

20 Einige Meilensteine (auch wenn meistens nur in Phase I) a aa a aa Anderson, 1990 Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm) 2002, science 296, 2410 ff) 1990, 1993, 2000, // ADA deficiency F Anderson, M Blaese 90/93/ C Bordignon 2000/2004 Isner, , 2000, Critical limb ischemia J Isner, I Baumgartner, , Hemophilia M Kay, K High Fischer, , 2002, X-SCID A Fischer, 2000/2002, Thrasher 2003 Kirn, 2000, Intravascular adenoviral agents in cancer patients: Lessons from clinical trials (review) dropped in 2004? licensed China 2005? 2001, 2003 ONYX oncolytic Viruses D Kirn (Cancer Gene Ther 9, p ) Manuel Grez Hans Peter Hossle Reinhard Seger 2004/2005 very encouraging data from just initiated clinical trial, prospected >10 patients 2004, Chronic Granulomatous Disease M Grez Frankfurt; R Seger Zürich UNIFR Rusconi 2006 Gendicine (approved China 2004) -> ! Hum Gene Ther 16, 1016 ff. H101 (approved in China, 2005) Sibiono Shenzen 2004/2005 Gendicine (adeno-p53 vector) L Peng, Sibiono Inc, Shenzen, China 25 Leben klar gerettet dank Gentherapie ~200 Leben Qualitätsverbessert ~nnn Leben gerettet oder verbessert in China mit Gendicine oder H101 ?

21 Die meist befürchtete Nebeneffekte der SGT a aa a aa Immunantwort zum Vektor Immunantwort gegenüber dem Frenden Gen allgemeine Toxizität der viralen Vektoren Verunreinigungen in den viralen Vektor-Präparate zufälliger Integratikon ins Wirtsgenoms, -> erhötes Tumor-Risiko Verunreingung des Genoms von Keimzellen Ergo Die Illusion der 90er Jahren ist verdunstet ZUstand der technologie ist noch unreif Indikation beschchränkt sich auf tödliche oder sonst schwere Krankheiten UNIFR Rusconi 2005

22 Paris, Jan 14, 2003, A Fischer: retrovirus X-SCID (bone marrow) same cohort a second patient developed a similar leukemia 30 trials in USA were temporarily suspended Paris, Oct 2, 2002, A Fischer: retrovirus, x-SCID (bone marrow) one patient developed a leukemia-like condition. Trial suspended and some trials in US and Germany on hold until UPenn, Sept. 19, 1999, J. Wilson: adenovirus, OTC deficiency (liver) one patient (Jesse Gelsinger) died of a severe septic shock. Many trials were put on hold for several months (years). Beispiele von Nebeneffekte 1: Von Pennsylvania bis Paris a aa a aa NY May 5, 1995, R. Crystal: adenovirus, cystic fibrosis (lung) one patient mild pneumonia-like condition Trial interrupted and many others on hold. UNIFR Rusconi 2006 Paris, Jan 24, 2005, A Fischer: retrovirus X-SCID (bone marrow) same cohort a third patient developed a similar leukemia Ergo SGT kann unter dem heutigen Technologischen Zustand Schwere Nebeneffekte verursachen

23 Beispiele von Nebeneffekte 2: Autoimmunität gegen EPO in experimentelle Affen a aa a aa Blood (2004), Vol. 103, No. 9, comment: pp Autoimmunity in EPO gene transfer (macaques) Els Verhoeyen and François-Loïc Cosset Papers: - Chenuaud and colleagues (page 3303) - Gao and colleagues (page 3300) inadvertent autoimmune response in nonhuman primates resulting from transfer of a gene encoding a self-antigen. - homologous EPO cDNA via AAV vectors - muscle or lung, - supra-physiologic serum levels of EPO UNIFR Rusconi 2005 K High, ASGT June meeting 2004 [Abstract1002] Immune Responses to AAV and to Factor IX in a Phase I Study of AAV-Mediated, Liver-Directed Gene Transfer for Hemophilia B Ergo Genexpression in den 'Falschen' Geweben führt zu detektierbaren Unterschiede in der Protein Faltung/Modifizierung Die Unterschiede können Autoimmunität auslösen Ein wichtiger Signal fuer alle die träumen sich mit EPO Gentransfer in den Muskeln zu dopen.

24 Abschnitt 5: Potential von Gentransfer für Dopingszwecke a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Wieso bleibt es attraktiv? Auf welchen Niveaus dürfte es anwendbar sein? Welche Funktionen könnte man modulieren? Beispiel Tierversuche (Lee Sweeney)

25 Doping mittels Gentransfer = 'gene doping') :...wieso bleibt es so faszinierend trotz den SGT Schwierigkeiten a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Gentherapie (Zusammenfassung) - Behandlung ist nicht erbbar - Anwendbar für jede Krankheitsklasse - Einige Vektoren wurden verbessert - Das prinzip hat in einigen Fällen funktioniert...aber: - Noch nicht klinisch konsolidiert - Heutige Technologie beinhaltet viele Risiken - Pionierzustand Dann: was macht Gentransfer so attraktiv für Doping? - mystisches Glauben in der 'Macht der Gene' - erscheint 'natürlicher' als traditioneller D. - man stellt es sich als 'permanent' vor - man stellt es sich 'besser' als konventioneller D. - man meint es sei 'undetektierbar' Ergo: Obiektiv betrachtet, sollte Gentransfer nur zur Behandlung von schweren Krankheiten beschränkt bleiben. Trotzdem interessiert sich den Doping feld vermehrt fuer Gentransfer-Techniken

26 Welche Funktionen kommen in Frage als Gendoping-Ziele? a aa a aa ex vivo, in hämatopoietische Gewebe: pro-hematopo. (Epo receptor, oxygen transport...) in vivo lokal (Beispiel Muskeln): metabolische Verstärker, Wachstumsfaktoren, Muskelfasern Modulatoren, Herzmodulatoredn (glucose/oxygen, MGF, IGF-1, anti-myostatin, Epo) in vivo lokal (beispiel gelenke und Sehne): Entzündungshemmer, Erholungsfaktoren, Reparaturfaktoren (anti-TNF, BMPs,...) in vivo systemisch: metabolische verstärker, Hormone, anti-Schmerzfaktoren (hormone metabolising enzymes, peptide hormones, proenkephalins,...) UNIFR Rusconi 2006 Ergo: Doping mittels Gentransfer hat vielfältige Anwendungsrichtungen

27 Das System IGF-1 -> growth factor for muscles AAV Vector, intra muscular Rat model, + or - training Die Resultate muscle force and muscle mass increased beyond levels obtained in training Die Tierexperimente von Lee Sweeney (2004) haben viel Staub aufgewirbelt... a aa a aa Transfer IGF-1 Gen (J. App Physiol 96, 1097 ff (2004)) Ergo ok, Dr. Sweeney, das gentransfer hat einige Resultate gebracht, aber training: IGF-1: muscle force UNIFR Rusconi Hier sind unsere Fragen - Kann man es auf Menschen extrapolieren? - Kg Muskeln zum transformieren? - Wie kann man genügend Vektor herstellen? - Symmetrie der Effekte? - Wie steht es mit Nebeneffekte?

28 Abschnitt 6: Gefahre und Limitierungen vom Gendoping a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Welche spezifische Nebeneffekte darf man sich erwarten? Technische und objektive Limitierungen Entdeckungsmöglichkeiten Vergleich mit konventionellem Doping

29 Erwartete Nebeneffekte vom Gendoping a aa a aa Mittel- und Kurzfristig Autoimmunität Hyperimmunität Toxischer Shock Langfristig Fibrose Tumoren Unzugänglichkeit zu spätere Gentherapie Besonders gefährlich: Rücksichtlosigkeit Ungeeignete Technik (niederes GCP Niveau) (ungeeigneter Vektor, geringe Kompetenz der Aerzte) Ungeeignetes Material (niederes GMP Niveau!) (pathogen oder pyrogen kontaminiert ) Ungenuegender follow-up sport hunter jones.mov UNIFR Rusconi 2006

30 Weitere Limitierungen vom Gendoping a aa a aa Gentransfer mit viralen Vektoren wieder-verabreiching blockiert allgemeine und geno-Toxizität Gentransfer mit nicht-viralen Vektoren allgemein ineffizient keine oder geringe Nachhaltung Weitere, Strategie-unabhängige Probleme Aufwendige und kaum zugängliche Technologie Langfristige Erhaltung der Genexpression ist schwierig Geringe Rückgängigkeit Unsymmetrie der Effekte (bei lokaler Verabreichung) Ergo: Risiken und Hürden scheinen höher als die Nutzen UNIFR Rusconi 2006

31 Entdeckungsmöglichkeiten vom Gendoping a aa a aa Entdeckungstechnologien Antibody detection (viral antigens) r-nucleic acids detection (PCR) recombinant protein / post-translational modification detection (MALDI-TOF, IEF, ELISA) Die Schwierigkeiten Anatomically difficult to detect (if locally administered) -> but leaves permanent genetic marking Detection of nucleic acids cannot be easily performed in body fluids (except in early phase) -> might require specific tissue biopsy Ergo Fremde Gen-reste darf man nur kurzfristig nach Gentransfer in Koerperflüssigkeiten aufspüren Fremde Gensequenzen sind aber langfristig in Geweben detektierbar Abnormale Produkte (inkorrekt prozessierte Eiweisse) koennen entstehen und sind detektierbar Aenderung einiger Reglemente zur Detektion und Sanktion? UNIFR Rusconi 2006

32 Vorteile und Nachteile vomGD im Vergleich zum konventionellen Doping a aa a aa Kategorie Drug/proteinGene-based Geschwindigkeit schnelllangsam Rückgangigkeit schnellLangsam Komplexitätsniveau tiefhoch verbundene Risiken je nachdemhoch Tarnung möglichschwierig Dosierung einfachschwierig Ergo: die Chancen sind theoretisch ziemlich alle gegen die Gendoping-Option Aber: das obige braucht gesunder Menschenverstand, eine seltene Eigenschaft im Doping-Feld (siehe Veterinärprodukte oder klinisch ungetestete Produkte auf dem Dopingmarkt) UNIFR Rusconi 2006

33 Abschnitt 7: Schlussfolgerungen und Perspektiven a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Kurzantworte an komplexe Fragen Danksagung

34 Schlussfolgerungen zum Gendoping: (Plakative Kurzantworte zu FAQ ) a aa a aa UNIFR Rusconi 2006 Denkt jemanden wirklich daran Gendoping bald anzuwenden? bestimmt! Welches Land wird die erste Gendoped Athleten 'anbieten'?...China? Ist es alles vielleicht nur einen Bluff (Abschreckungsmittel)? vielleicht auch... Wird Gendoping effizienter als traditioneller Doping sein? Nein Wird es Opfern der Gendoping Nebeneffekte geben? Ja, bestimmt Welches Gen wird als erste gewaehlt für GD? Epo, dann IGF-1 Wird Gendoping schwierig zum entdecken bleiben ? Nein Welche Sportart wird vermutlich 'das erste Fall' schaffen? Pferderennen? Wieso bleibt GD so attraktiv? Ignoranz, Ehrgeiz, Gier

35 für evenktuelle Fragen: info zur SGT und download dieser Slides Show : Danke, und hoffen wir, dass der Sport uns noch über lange Zeit Emotionen mit viel Fairplay schenken wird a aa a aa meine Mitarbeiter an der UNIFR Winterthurer Fortbildung - Dr. D. und A. Kappeler - Dr. P.E. Mullis UNIFR Rusconi 2006

36 a aa a aa UNIFR Rusconi 2002


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