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Inhalt Theorie Einleitung SDS-PAGE SDS-PAGE Probenvorbereitung Coomassie Gelfärbung Versuchsdurchführung Ergebnisse Literatur [1] 2 SDS-PAGE Meike Flentje.

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Präsentation zum Thema: "Inhalt Theorie Einleitung SDS-PAGE SDS-PAGE Probenvorbereitung Coomassie Gelfärbung Versuchsdurchführung Ergebnisse Literatur [1] 2 SDS-PAGE Meike Flentje."—  Präsentation transkript:

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2 Inhalt Theorie Einleitung SDS-PAGE SDS-PAGE Probenvorbereitung Coomassie Gelfärbung Versuchsdurchführung Ergebnisse Literatur [1] 2 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

3 Einleitung Ziel: Produktion und Aufreinigung von dem Protein FGF-2 Es handelt sich um einen Wachstumsfaktor Dieser bindet an den FGF-2 Rezeptor und führt zur Dimerisierung [2] 3 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

4 SDS-PAGE Eindimensionale Auftrennungsmethode nach der Größe Diskontinuirliches Tris-HCL / Tris-Glycin Puffersystem Sammelgel: weitporig, pH 6,8 und geringere Pufferstärke sowie Stapelung der Proteine Glycin: Folge-Ion wegen geringer Mobilität Chlorid: Leit-Ion wegen hoher Mobilität 4 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

5 SDS-PAGE Trenngel: pH 8,8 sowie eng porig und damit erfahren die Proteine einen höheren Reibungswiderstand Folge: bessere Auftrennung und schärfere Banden [3] 5 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

6 SDS-PAGE Probenvorbereitung Red. Laufpuffer mit einem Überschuss an SDS Erwärmung der Proben auf 95 °C Denaturierung DTT spaltet die Disulfidbrücken SDS kann sich anlagern und eine negative Mizelle bilden, damit werden Eigenladungen abgeschirmt -> Gesamtladung ist proportional zur Proteingröße [4] 6 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

7 Coomassie Gelfärbung Farbmittel: Coomassie Brillant Blue R-250 Unspezifische Proteinfärbung Interaktion mit den basischen Resten, damit werden Lysin, Arginin und Histidin detektiert 7 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

8 Versuchsdurchführung Gel gießen Probenvorbereitung Proben auftragen Gellauf Coomassie Färbung 8 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

9 Ergebnisse 9 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab Abb. : SDS-PAGE nach der Kultivierung: 1: Vorkultur (A) (7 μL); 2-7: 12 h-22 h (B) (7 μL); 8-13: 22 h-32 h (A) (7 μL); M: Protein-Marker (3 μL) Abb. 3: : 14: 34 h (A) (7 µL); 15-20: 34 h- 44 h (B) (7 µL); 21: 46 h (A) (7 µL); M: Protein-Marker (3 µL); 22: Gesamtzellprotein (A) (7 µL); 23: lösliche Proteine (A) (7 µL); 24: unlösliche Proteine (A) (7 µL); 25: Gesamtzellprotein (B) (7 µL); 26: lösliche Proteine (B) (7 µL); 27: unlösliche Proteine (B) (7 µL)

10 Ergebnisse 10 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab Abb. 4: SDS-PAGE nach der Kationenaustausch-Membran- Chromatographie: Probe 1-23 (10 μL); M: Protein-Marker (3 μL)

11 Ergebnisse 11 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab Abb. 5: SDS-PAGE nach der Heparin-Sepharose- Affinitäts-Chromatographie: M: Protein-Marker (3 μL); 1-16: Probe (10 μL)

12 Ergebnisse 12 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab Abb. 6: Zusammenfassung der Ergebnisse: 1: Gesamtzellprotein (B) (10 μL); 2: lösliche Proteine (B) (10 μL); 3: unlösliche Proteine (B) (10 μL); M: Protein-Marker (4 μL); 4-5: Heparin-Sepharose- Affinitäts-Chromatographie K + M (15 μL)

13 Vielen Dank für eure Aufmerksamkeit SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab 13 Fragen?

14 Literatur [1] Atherton, B. A.; Cunningham, E. L.; Splittgerber, A. G.: A mathematical model for the descrip-tion of the Coomassie brilliant blue protein assay. In: Anal Biochem. 233(2), S (1996). [2] Fazekas de St. Groth, S.; Webster, R. G.; Datyner, A.: Two new staining procedures for quantit-ative estimation of proteins on electrophoretic strips. In: Biochimica et Biophysica Acta. 71, S. 377–391 (1963). [3] Laemmli, U. K.: Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacterio-phage T4. In: Nature. 227, S (1970). [4] Lottspeich, H.; Zorbas, H.: Bioanalytik. 1. Aufl. Heidelberg: Spektrum, Akad. Verl. (1998). [5] Reinard, T.: Molekularbiologische Methoden. 1. Aufl. Stuttgart: Eugen Ulmer KG. (2010). 14 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab

15 Literatur - Bild Bild 1: Bild 2: http://www.pnas.org/content/96/7/3658/F2.expansion.html Bild 3: https://www.goldbio.com/FGF2-Basic-FGF-Human-P5983- C241.php; https://www.goldbio.com/FGF2-Basic-FGF-Human-P5983- C241.php Bild 4: rad.com/evportal/en/US/LSR/Solutions/LUSOW4GRI/Protein- Electrophoresis-Methods; http://www.bio- rad.com/evportal/en/US/LSR/Solutions/LUSOW4GRI/Protein- Electrophoresis-Methods 15 SDS-PAGE Meike Flentje & Julia Schwab


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