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6. Vorlesung 3. Genregulation (Phänomene und Datenquellen) Eigenschaften metabolischer Prozesse Genexpression Genwirkketten Modellierung des Promotors.

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Präsentation zum Thema: "6. Vorlesung 3. Genregulation (Phänomene und Datenquellen) Eigenschaften metabolischer Prozesse Genexpression Genwirkketten Modellierung des Promotors."—  Präsentation transkript:

1 6. Vorlesung 3. Genregulation (Phänomene und Datenquellen) Eigenschaften metabolischer Prozesse Genexpression Genwirkketten Modellierung des Promotors Vorlesung Modellierung & Simulation Überblick

2 Ergebnis:Die DNA zeigt auf der Ebene der analysierten Strukturen komplexe Sprachkonstrukte. Zusammenfassende Darstellung der Eigenschaften: 1.Genom ist modular Anweisungen und Module können überlappen. 2.Metabolismus ist probabilistisch Operationsstärke einer 'elementar anwendbaren Anweisung ‘. 3. Genom ist dynamisch Transposon, Genfähre, Rekombination und Mutation. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

3 4.Simultane Aktivierung Nebenl ä ufige Genexpression und katalyse. 5.Granularität der genetischen Prozesse Konzentration der Proteine etc. ist variabel. 6.Datenfluss Daten und Kontrollanweisungen steuern den Programmfluß. 7. Der genetische Speicher ist kein adressierbarer Raum. Genom repr ä sentiert auch evolutionärer Redundanz. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

4 Modellierung der Genexpression 1944 Transformationsversuche  DNA Träger der genetischen Information 1953 Watson und Crick  Modell der DNA 1963Jacob und Monod  Modell der Genregulation 60er  Genetischer Code Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

5 Gen = Cistron (moderner Genbegriff) DNA-Abschnitt, der sich aus linear verknüpften Nukleotiden zusammensetzt und eine biochemische Funktion repräsentiert. Strukturgen DNA-Abschnitte, die in die primäre mRNA übersetzt werden (Transkription). Promotorgen DNA-Abschnitt mit Affinität zur RNA-Polymerase. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

6 Transkription: 1.Genetischer Code: Triplets werden nichtüberlappend und kommafrei übersetzt. 2. Genetischer Code: Jedes tRNA Molekül trägt eine spezifische Aminosäure. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

7 Operatorgene DNA-Abschnitt mit Affinität zu Regulatorproteinen. Terminatorgene DNA-Abschnitt zur Beendigung der Transkription. Regulatorgen DNA-Abschnitt codiert für ein Regulatorgen. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

8 Induktives System Substrat inaktiviert den spezifischen Repressor direkt oder indirekt. Repressives System Regulatorgen codiert einen inaktiven Repressor, der erst durch Bindung eines Endproduktes einer Biosynthesekette aktiv wird. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

9 PromotorOperatorStrukturgenTerminatorRegulator Docking / Repressor Enzym tRNA rRNA Proteine Transkription Stop Transkription Start microRNA AntisenseRNA siRNA

10 Promotor Operator Strukturgen S 1 S 2 S 3 Terminator Regulator Transkription mRNA (primär) Splicen mRNA (sekundär) Translation Enzyme E1E1 E3E3 E2E2 Biosynthese Substrat/Produkt- kette Genwirkkette

11 Promotor Operator Strukturgen S 1 S 2 S 3 Terminator Regulator E1E1 E3E3 E2E2 S P Induktives System Substrat deaktiviert Repressor !

12 Promotor Operator Strukturgen S 1 S 2 S 3 Terminator Regulator E1E1 E3E3 E2E2 S P Repressives System Produkt aktiviert Repressor !

13 Klassisches Modell der Genregulation Grundlegend: Lac Operon (Jacob und Monod) Auf der Ebene der Transkription wird die Genregulation bruchstückhaft verstanden. Offene Frage: Kinetik der Genregulation: Wie häufig wird ein Strukturgen übersetzt ? Wie häufig wird ein Protein synthetisiert ? Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

14 Zur Klärung dieser Fragen: - Konzentration der RNA-Polymerase, - DNA Sequenzen (Enhancer, Promotor etc.) legen die Affinität zwischen RNA Polymerase und Promotor fest, - Lebensdauer der mRNA, - Rolle der RNA, - Anzahl der Ribosomen, - Affinität mRNA/Ribosom und - Affinität DNA/Induktor/Repressor. Phänomen der Genregulation !? Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

15 Verschiedene Ebenen der Genregulation: Struktur der DNA (Topoisomerase) DNA auf Histone und Nichthistone aufgewickelt, die in ihrer Struktur veränderbar sind (Methylierung, Acetylierung und Phosphorylierung). Topoisomerase – Modifikation des Verdrillungsgrades Granularität (RNA-Polymerase etc.) Genetische Information der RNA etc. unterliegt der Genregulation. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

16 Verschiedene Ebenen der Genregulation: Transkription Fundamentale Ebene der Genregulation (Promotoraffinität). RNA - Antisense RNA Transkription auf Mutterstrang – Sense Strang (komplementär: Antisense). Splicen Lebensdauer Die mRNA hat unterschiedliche Lebensdauern: Minuten bis Tage. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

17 Translation Affinität zu den Ribosomen. Amplifikation Zellstoffwechsel benötigt hohe Konzentration spezifischer Substanzen:  Vervielfachung der Baupläne Attenuation (Abschwächung) Translation biochemisch bremsen. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

18 Ebene der Transkription: Mensch: ca Strukturgene Komplexe Promotorsequenzen:Transkriptionsfaktoren Promotoraffinität:Enhancer Komplexe Gensteuerung:Homöogene (Bsp. Taufliege) Fundamental: Lac-Operon bei E. coli Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

19 Lactoseverwertung Lactose (außerhalb der Zelle) Lactose (innerhalb der Zelle) Galactose Glucose Lactose-Permease (Y)  -Galactosidase + Transacetylase (Z)

20 P Strukturgene: lacZ lac Y lac A T Lac-Operon und sein Regulationsgen lacI mRNA lacZ lacY lacA LacI lacZ lacY lacA P T P T O

21 Lac-Operon und seine Regulation LacI lacZ lacY lacA P T P T O Operator Promotor mRNA lac-Repressor P TT RNA-Polymerase Kann nicht binden O P

22 Lac-Operon und seine Regulation P T P T O P T O LacI lacZ lacY lacA mRNA lac-Repressor Allolactose Repressor inaktiv RNA-Polymerase kann binden Transkription mRNA

23 viele Lactose- moleküle alle Repressormoleküle haben Allolactose gebunden mäßige Menge an Lactosemoleküle nur wenige Repressormoleküle haben Allolactose gebunden sehr wenig Lactosemoleküle kein Repressor hat Allolactose gebunden

24 Ende von lacI CAP-Bindung Operator Promotor Beginn von lacZ Glucose hemmt die cAMP-Synthese ATP Adenin Adenylcyclase Glucose hemmt Adenin zyklisches AMP

25 CAP-cAMP stimuliert die Transkription P O CAP-Bindungsstelle frei lac-mRNA P O CAP-cAMP lac-mRNA Niedriger Glucosespiegel Aktivierung der Transkription

26 P O lac-mRNA P O CAP-cAMP lac-mRNA Aktivierung der Transkription Glucose Lactose Niedriger cAMP-Spiegel, CAP-Stelle frei Glucose wird zuerst verbraucht lacZ hoher cAMP-Spiegel, CAP-Stelle besetzt

27 Sequenzanalyse und Genregulation DNA-Sequenz = Wort über dem Alphabet {A,T(U),G,C}. = Folge von Zeichen (characters), deren Länge zwischen 1 und ca variieren kann. Durchschnittliche Länge (Datenbank) ca Basen. Sind immer alle Basen einer Sequenz bekannt ? Mehrdeutigkeiten erfassen: Erweiterung des Arbeitsalphabets. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

28 SymbolBedeutungSymbolBedeutung YC oder TMA oder C WA oder THA oder T oder C SG oder CKG oder T BG oder T oder CRG oder A VG oder A oder CDG oder A oder T XG oder A oder T.Lücke oder C Tabelle. Das Arbeitsalphabet IUPAC setzt sich aus den Basen und den hier dargestellten Zeichen zusammen.

29 SymbolBedeutungSymbolBedeutung BA oder AADC oder CC HG oder GGVT oder TT KC oder CXLT oder TX MA oder AXNG oder GX RA oder GYC oder T XA oder G oder T-A oder G oder Toder C 1Lücke oder C2Lücke oder T 3Lücke oder A4Lücke oder G 5A oder C6G oder T 7A oder T8C oder G Tabelle: Basenbezeichnung nach Roger Staden

30 Jeder Forscher ist bemüht, diese Mehrdeutigkeiten bei der Aufklärung der Sequenzen zu beseitigen. Der internationale Mehrdeutigkeitscode beansprucht 4 Bits: BitsequenzSymbolBitsequenzSymbol A 0001T/U1001W 0010G1010R 0011K1011D 0100C1100M 0101Y1101H 0110S1110V 0111B1111X/N

31 Sequenzanalyse und Probleme der EDV: - Einsatz der unterschiedlichen Datenformate, - Benutzung verschiedener Codes und - Fehlerraten. 1. Schritt: Lesen des Gels – automatische Ermittlung der Sequenz Konflikte (2 x lesen) markieren und vom Benutzer oder per Nachsequenzierung klären. Grundregel: Man erlaubt eine ca. 1%ige Fehlerrate pro Fragment. Sequenz ?  DNA-Funktionseinheiten ermitteln. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

32 2. Schritt: Automatische Identifizierung der Funktionseinheiten Zentrale Frage: Identifizierung der Transkriptionseinheiten Statistische Methoden  charakteristische Sequenzen  Konsensus-Sequenz. Solche Sequenzen extrahieren aus: - Literatur oder - Datenbanken (z.B. TRANSFAC). Heuristiken sind erforderlich ! Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

33 Beispiel: Identifizierung von Transkriptionseinheit Algorithmische Identifikation – naiver Ansatz:  Identifikation der Start- und Stopptripletts;  Identifikation der Intron/Exon-Grenzen;  Identifikation der Promotoren;  Identifikation der Terminatorsequenzen;  Identifikation der Shine-Dalgarno-Sequenz. Identifikation dieser Strukturen ausreichend ? Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

34 Prokaryonten:Hier ist die automatische Identifikation der Promotoren leichter, weil die bereits sequenzierten Promotoren statistisch eine recht einheitliche Sequenz aufweisen. Eukaryonten:Hier kennt man eine Vielzahl von Signalen, die in einer unüberschaubaren Kombination auftreten. RNA-Polymerase von Prokaryonten unterteilt sich in: - Sigmafaktor und - Core-Enzym. Sigmafaktor identifiziert den Promotor. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

35 Sigmafaktoren, die verschiedene Promotorklassen erkennen: 1.RNA-Polymerase bindet locker an einen beliebigen Teil der DNA und wandert von dort aus den Strang entlang, bis ein Promotor gefunden wird, an dem dann eine feste Bindung stattfindet. 2.Sigmafaktor nur an der Initiation beteiligt. Für die Elongation wird dieser von dem Core-Enzym abgelöst, damit eine lockere Bindung an der folgenden DNA-Sequenz möglich ist. 3.RNA-Polymerase ohne Sigmafaktor - wandert die DNA entlang, bis ein Stoptriplett auftritt. Dann löst sich auch das Core-Enzym von der DNA und vereinigt sich erneut mit dem freiliegenden Sigmafaktor zum Holoenzym. Woran erkennt der Sigmafaktor nun den Promotor ? Jeder Promotor hat spezifische Subsequenzen ! Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

36 Mindestlänge der Subsequenzen ? Solche Signale kommen in allen Promotoren vor; deshalb bezeichnet man sie auch als konserviert. Überlagerung aller bekannten Promotoren  Konsensus-Sequenz ablesen. Nur wenige Promotoren entsprechen der exakten Struktur der Konsensus-Sequenzen, aber als Faustregel gilt: Je ähnlicher die jeweiligen Promotorabschnitte den Konsensus- Sequenzen sind, desto stärker ist der Promotor und umgekehrt. Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

37 Sequenzvergleich bei Prokaryonten hat an zwei Stellen eine Konsensus-Sequenz identifiziert: - 10 Nukleotidepaare stromaufwärts vom Transkriptionsstart (+1) liegt eine Sequenz von 6 Nukleotiden, die große Ähnlichkeit mit der Folge 5-TATAAT-3 aufweist, die auch als Pribnow-Box bezeichnet wird. - An der Position -35, mitten in einem AT-reichen Abschnitt, liegt meistens die Folge 5-TTGACA-3. Muster-Promotor des E-coli Genoms aufstellen: Position: Sinnstrang5’ TCTTGACA--- TATAAT-- CAT-- 3’ Gegenstrang3’ AGAACTGT-- ATATTA-- GTA-- 5’

38 Prominenteste Bindungsstelle: Pribnow Box Stormo: Veranschaulichung der Problematik Pribnow gibt die folgenden Bindungssequenzen an: TACGAT TATAAT TGTAAT GATACT TATGAT TATGTT Konsensus-Sequenz:TATAAT Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation

39 Statistik – Auftreten dieser Sequenz im Genom: Konsensus-Sequenz: TATAAT 1.Gleichverteilung der Basen:4096 bp 2.1x Mismatch zulassen: 170 bp 3.2x Mismatches zulassen: 34 bp Verwendung von TATRNT Mismatch zulassen: 28 bp Stormo (2000) Vorlesung Modellierung & Simulation3. Genregulation


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