VL Reihe – „Weiße Biotechnologie“

Präsentation zum Thema: "VL Reihe – „Weiße Biotechnologie“"—  Präsentation transkript:

1 VL Reihe – „Weiße Biotechnologie“
Beiträge der AG Maskow – Extremophile Mikroorganismen – interessante Biokatalysatoren? – Aufarbeitung und Bioprozessführung – getauscht mit A. Zehnsdorfer Von der gläsernen zur maßgeschneiderten Zelle? Thermodynamik zellularer Prozesse

2 Extremophile Mikroorganismen interessante Biokatalysatoren?
– interessante Biokatalysatoren? Stand:

3 E-mail: thomas.maskow@ufz.de
Für Anfragen und Anregungen : PD Dr. Thomas Maskow Helmholtzzentrum für Umweltforschung - UFZ Department Umweltmikrobiologie Permoserstr. 15 Tel / Fax: 0341/

4 Inhalt: Warum sind extremophile Mikroorganismen interessant ?
Quellen extremophiler Mikroorganismen Pheno- und genotypische Besonderheiten Technische Bedeutung extremophiler Mikroorganismen Potential extremophiler Mikroorganismen und Ausblick

5 We teach microbiology But we learn from microbes

6 Gewaltiges Synthesepotenzial  technische Anwendungen !!!
Das versteckte Potenzial der Mikroorganismen: • Die Zahl der prokaryotischen Zellen 6,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000 (6 x 1030) • 50% des Weltkohlenstoffes, 90% des Stickstoffs und Phosphors, sowie 108 Spezies. 1 Gramm Boden < 109 Bakterien mit – Spezies. • Stammsammlungen beinhalten < 105 Spezies > 90% manchmal >99% der Spezies einer Umweltprobe sind noch nicht kultivierbar. Versteckte Diversität von Pilzen + Protisten kaum untersucht. E. coli etwa 2000 metabolische Reaktionen Gewaltiges Synthesepotenzial  technische Anwendungen !!!

7 Extremophile (überleben unter „lebensfeindlichen“ Bedingungen)
Resistenzmechanismen Besondere Produkte Autosteriles Arbeiten Extremozyme Temperatur – vR Halotolerant – C(Edukt, Produkt) pH – Waschmittelzusätze Protektormoleküle Sterilität – Kostenfaktor biotechnologischer Verfahren

8 Quelle: www.mibi.uni-bonn.de/extremophile.jpg

9 Quellen (Habitate) extremophiler Mikroorganismen

10 Extremophile:: Bauwerke Heiße Quellen Salzseen
Hyperthermophile (- 105°C) Psychrophile (-7 – 15oC) • Halophile (- Sättigung) • Acidophile (- pH 0,5) • Alkaliphile (- pH 11) Baro- oder Piezophile (> 800 atm) Sodaseen/-wüsten Tiefsee Tiefsee Gletscher

11 Nutzung von Extremophilen
HYPERTHERMOPHILE (Quelle) Nutzen DNA polymerase DNA amplification by PCR Alkaline phosphatase Diagnostic Proteasen und Lipasen Milch produkte Lipasen, pullulanases and proteases Detergentien Proteasen Bäckerei und Brauerei, Aminosäure produktion aus Keratin Alkoholdehydrogenase Chemische Synthesen Xylanases Papierbleiche S-layer proteine und Lipide Molekulare Siebe Oil abbauende Mikroorganismen Surfactants für die Ölgewinnung Schwefeloxidierende Bakterien Bioleaching, Kohle & Abgas Entschwefelung Hyperthermophilic consortia Abfallbehandlung und Methan- produktion Die (auch Pullulan-6-Glucanohydrolase) ist ein bakterielles Enzym, das unter anderem von Klebiella synthetisiert und exprimiert wird und den extrazellulären Abbau des pflanzlichen Polysaccharid Pullulan erlaubt. Solche Enzyme nennt man auch Exoenzyme. Die Monomere werden anschließend von den Bakterien aufgenommen. Xylanasen sind Enzyme aus der Gruppe der Pentosanasen die verschiedene, im Stützgerüst der pflanzlichen Zellwände vorhandenen Substanzen (Xylane) aufschließen können.[1] Sie kommen natürlich in Bakterien, Pilzen, Protozoen, Algen, xylophagen Indekten, Schneken und Krebsen, jedoch nicht in Wirbeltieren (diese verdauen diese Stoffe durch ihre Darmflora) vor. Für den industriellen Einsatz werden Xylasen häufig gentechnisch aus Pilzen (z-B. Aspergillus- und Trichodermaarten) und Bakterien hergestellt Keratin (von griech. kéras, Genitiv kératos = Horn) oder ist ein Sammelbegriff für verschiedene wasserunlösliche Faserproteine, die von menschlichen oder tierischen Organismen gebildet werden. Entsprechend ihrer molekularen Konformation als alpha-Helix oder Beta-Faltblatt unterscheidet man α- und β-Keratine. Keratine sind der Hauptbestandteil von Säugetierhaar, Reptilienschuppen, Federn, Nägeln, Krallen und Klauen, Hörnern und den Barten der Wale.

12 Alkaline phosphatasen Molekularbiologie
PSYCHROPHILE Nutzen Alkaline phosphatasen Molekularbiologie Proteasen, Lipasen Detergentien , Zellulasen und Amylasen Lipasen und Proteasen Käseherstellung und Milchverarbeitung Proteasen Reinigungslösung für Kontaktlinsen Ungesättigte Fettsäuren Nahrungsmittelergänzung, Diätzusätze b-galactosidasen Laktose Hydrolyse in Milchprodukten Ice nucleating proteins Künstlicher Schnee, Eiskrem Ice minus microorganisms Frostschutz für empfindliche Pflanzen Verschiedene Enzyme Bioremediation, Biosensoren (e.g. oxidases) Methanogene Methanproduktion Pseudomonas syringae ist ein gramnegatives, stäbchenförmiges Bakterium der Gattung Pseudomonas. Es wurde im Jahr 1902 als Pflanzenpathogen des Gemeinen Flieders (Syringa vulgaris) isoliert. Da es die Eiskeimbildung von unterkühltem Wasser, welches bei absoluter Reinheit bis -40 °C flüssig bleibt, bis zu einer Temperatur von -1,5 °C katalysiert, ist es in der Landwirtschaft und Biotechnologie von Interesse. Eine Besonderheit des Bakteriums ist, dass es als organischer Keim für die Bildung von Wassereis dienen kann. Hierbei katalysiert es den Prozess bis zu einer Temperatur von -1,5 °C. Dies ist insofern sehr effektiv, als die meisten organischen oder anorganischen Partikel, die zur Keimbildung genutzt werden, unter -10 °C aktiv sind.

13 Proteasen, Cellulasen, Xylanasen, Detergentien
ALKALIPHILE (Quelle) Nutzen Proteasen, Cellulasen, Xylanasen, Detergentien Lipasen and Pullulanasen Proteasen Gelatine Entfernung von Röntgenfilmen Elastasen, Keritinasen Enthaarung Cyclodextrine Lebensmittel, Transport und Schutz von Wirkstoffen, Enantiomerentrennung, Pharmazie Alkaliphile Halophile Ölgewinnung Verschiedene Mikroorganismen Antibiotika ACIDOPHILE (Quelle) Nutzen Schwefel oxidierende Metallgewinnung und Entschwefelung von Mikroorganismen Kohle Mikroorganismen Organische Säuren und Lösemittel Die Cyclodextrine werden im Allgemeinen aus Stärke gewonnen, die von speziellen Bakterien (z. B. Bacillus macerans) enzymatisch abgebaut wird. Zum Einsatz kommt dabei vor allem Maisstärke - industriell interessant ist insbesondere die sortenreine Gewinnung von Cyclodextrinen, um die verschiedenen Hohlraumdurchmesser je nach einzuschließender Substanz auswählen zu können. Allen niederen Cyclodextrinen eigen ist die hydrophobe Kavität im Innern und die polare Außenfläche. Dadurch sind die Cyclodextrine in der Lage, so genannte Einschlussverbindungen mit apolaren organischen Verbindungen zu bilden. Diese Fähigkeit und ihre Wasserlöslichkeit machen sie zu einem immer wichtigeren Gegenstand der pharmazeutischen Forschung, da die Komplexe mit Pharmazeutika in der Regel besser wasserlöslich sind als die reinen Pharmazeutika und daher auch im Körper leichter verfügbar sind. Weiterhin ist ihre Fähigkeit, die eingeschlossene Substanz vor UV-Strahlung und umgebenden Verbindungen (z. B. Sauerstoff) zu schützen sowie die eingeschlossenen Substanzen über einen längeren Zeitraum abzugeben, von großem Interesse.

14 Alkohol dehydrogenase
Alkohol dehydrogenase (ADH) von der Archaea Sulfolobus solfataricus Arbeitet unter harschen (vulkanischen) Bedingungen 88°C (fast siedendes Wasser), pH= 2 – 3.5 (Schwefelsäure-konzentrationen wie in Autobatterien) ADH katalysiert die Konversion unterschiedlicher Alkohole und hat erhebliches biotechnologisches Potential wegen seiner besonderen Stabilität

15 Halo- und osmophile Mikroorganismen

16 Extrem durch niedrige Wasseraktivitäten
Habitat Bewohner 1.000 Reines H2O Caulobacter, Spirillum 0.995 Menschliches Blut Streptococcus, Escherichia 0.980 Meerwasser Pseudomonas, Vibria 0.800 Marmelade, Obstkuchen Penicillum 0.750 Gesalzener Fisch, Salzseen Halobacterium, Halococcus 0.700 Getreide, Trockenobst Xerophile Pilze 1 g gereinigtes Meersalz enthält 106 Mikroorganismen !!! Wasseraktivität beeinflusst durch: Salze Zucker Wassermangel Halotolerant/-phil Osmophil Xerophil

17 Halotolerant oder Halophil ?
NaCl-Gehalt Bezeichnung 1 – 6 % Schwach halophil 6 – 15 % Moderat halophil > 15 % Extrem halophil Tolerieren höhere Salzgehalte, sind aber nicht darauf angewiesen

18 Quelle von Halophilen Salzsee Südrussland, Luftbildaufnahme

19 Sodaseen: Etoscha-Pfanne, Namibia

20 Künstliche Habitate: Salzgewinnung aus Meerwasser
Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press

21 Als (Lichen) bezeichnet man eine symbiotische Lebensgemeinschaft zwischen einem Pilz, dem so genannten Mykobionten, und einem oder mehreren Photosynthese betreibenden Partnern. Diese Photobionten, auch Phytobionten genannt, sind Grünalgen (Chlorophyta) oder Cyanobakterien. Die Eigenschaften der Flechten setzen sich deutlich von jenen der Organismen ab, aus denen sie sich zusammensetzen. Erst in der Symbiose bilden sich die typischen Wuchsformen der Flechten heraus und nur in Lebensgemeinschaft mit einem Photobionten bilden die Mykobionten die charakteristischen Flechtensäuren. Die Wissenschaft von den Flechten ist die oder . Weltweit gibt es rund Flechtenarten. In Mitteleuropa kommen davon etwa vor. Der Anteil endemischer Arten ist bei Flechten viel niedriger als bei Blütenpflanzen. Flechten werden immer nach dem Pilz benannt, der die Flechte bildet, da es meist dieser ist, der ihr die Form und Struktur gibt. Während mehrere Photobionten in einer Flechte vorhanden sein können, findet man immer nur eine Pilzart. Flechten werden daher den Pilzen (Fungi) zugerechnet, unter denen sie als eigene Lebensform eine Sonderstellung einnehmen; sie sind also keine Pflanzen. Trockene Oberflächen

22 Resistenzmechanismen
Salt – in Strategie Compatible-Solute Strategie Osmotisches Gegengewicht: K+ Kleine, organische Moleküle; Kompatibel zum Metabolismus (Compatible Solutes) Vorteil: Standard-Enzyme „kostet“ wenig Energie; Na+/H+ Antiporter; 1:2 - 2:3 primäre Na+ Pumpen Nachteil: Benötigt spezielle, salz-tolerante Enzyme Energetische Kosten der Synthese von Compatible Solutes Vertreter: aerobe extrem halophile Archea, Halobacteriales anaerobe extrem halophile Archea, Haloanaerobiales Vertreter aus allen 3 Domänen des Lebens Archea Bacteria Eucarya

23 Bisherige technische Anwendungen  Habitat
Quelle für Carotinoide (Bacterioruberine) als Nahrungsergänzungs- mittel, -färbemittel Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press Produzenten während der Fermentation von Sojasoße und Thaifischsoße

24 Widerstehen hohen Ionenstärken
Halophile Enzyme Widerstehen hohen Ionenstärken Interessant für hohe ionische Edukt-/ Poduktkonzentrationen

25 Halophile dihydrofolat Reductase des Aarchaeon Haloferax volcanii, isoliert aus dem Toten Meer
Einzigartige molekulare Struktur (aktiv, stabil und löslich bei hohen Ionenstärken) Hoher Anteil saurer AS Kleiner Anteil hydrophober AS viele Salzbrücken Aber: noch vieles unbekannt (), auch Dihydrofolsäure-Reduktase, heißen Enzyme, die Folsäure zu Dihydrofolsäure (DHF) und DHF zu Tetrahydrofolsäure (THF) hydrieren. Diese Reaktionen aktivieren das Vitamin Folsäure und sind unentbehrlich für die Nukleotid-Biosynthese in allen Lebewesen. Beim Menschen kommt DHFR in allen Gewebetypen vor. Mutationen am DHFR-Gen können DHFR-Mangel und dieser megaloblastäre Anämie verursachen.[1]

26 Vergleich der dihydrofolat Reductase
Halophil nicht-halophil

27 Anwendungen Viele mögliche Anwendungen von Halophilen werden untersucht: Erdölextraktion Gentechnischer Einbau halophiler Enzyme in Pflanzen um die Salztoleranz zu steigern. Behandlung von Abwässern.

28 Bacteriorhodopsin Physiologische Funktion: Licht grüner Spektralbereich 570 nm - protonenmotorische Kraft Arbeitsweise: Ändert Protonisierung/Farbe in 10 ms -> technische Anwendungen pumpt ein Proton pro Photon

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30 Technisches Potential von BR folgt aus Licht ->Signal zu wandeln:
Ladungstrennung Farbänderung Technische Anwendungen: Elektrostatische Energie -> photovoltaische Zelle Prototyp: 5-10 Jahre Bewegungssensoren Prototypen entwickelt künstliche Netzhaut Prototypen entwickelt Licht -> elektrisches Signal -> Photozelle Während der Lichtspeicherung ändert BR die Farben Lichtmodulatoren Hochauflösende Displays Prototyp entwickelt Genetische Techniken helfen: Variation der Lebensdauer der Zustände Anregungswellenlänge Grundlage für 3D Speicher extrem kleiner Größe (1 Molekül reicht), hoher Speicherkapazität pro Volumeneinheit

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32 Compatible Solutes – Protektormoleküle !
Primär osmotisches Gegengewicht aber auch generelle Schutzfunktion! Schützen: Enzyme, biologische Strukturen aber auch ganze Zellen gegen: Hohe Ionenstärken Trockenheiten Hohe Temperaturen Niedrige Temperaturen Gefrieren Denaturierende Lösemittel UV-Strahlung

33 Compatible Solutes – Protektormoleküle !
Ursachen der generellen Schutzfunktion? Preferential exclusion theory: Unterstützen die Wasserstruktur CS verstärken hydrophobe Kräfte CS wirken der Entfaltung von Proteinen entgegen Arakawa, T und Timascheff SN (1985) The stabilisation of proteins by osmolytes. Biophys. J. 47: Suenobu K, Nagaoka M (1998) Ab into molecular orbital study on molecular and hydration structure of ectoine. J. Phys. Chem. A 102:

34 Compatible Solutes: Struktur -> Funktion ?
Vom Aminosäuretyp: Glycinbetain Prolin Ectoin O H C 2 Vom Kohlenhydrattyp: Trehalose Sucrose C H 2 O Vom Polyoltyp: Glycerol Mannitol Anderer Typen: Dimethylsulfoniumpropionat

35 Welche Compatible Solutes kommen woher?
Mikroorganimus Compatible Solutes Nichtphototrophe, grampositive Bakterien Glycinbetain, Prolin Nichtphototrophe, gramnegative Bakterien Glutamat Süßwasser-Cyanobakterien Saccharose, Trehalose Marine Cyanobakterien Glycosylglycerin Marine Algen Mannit, verschiedene Glykoside, Prolin, Dimethylsulfonpropionat Salzsee-Cyanobakterien Glycinbetain Halophile anoxygene phototrophe Bakterien Glycinbetain, Ectoin, Trehalose Extrem halophile Archea KCl Halophile Grünalge Dunaliella Glycerin Xerophile Hefen Xerophile fadenförmige Pilze

36 Bakterienmelken Vorzüge: 3-4 Zyklen möglich Quelle: www.bitop.de
1. Phase (Wachstum und Synthese) Wachstum und Ectoinbildung in Gegenwart hoher Ionenstärken 3. Phase (Synthese) Auffüllen mit hochkonzentrierter Salzlösung, Synthese von CS 2. Phase (Produktabtrennung) Biomasse angereichert cross-flow Filtration. hypoosmotischen Shock -> Freisetzung der CS durch die MSC. Zelllyse findet nicht statt, hohe Produktreinheit Biomasse wird angereichert, CS im Permeat Vorzüge: 3-4 Zyklen möglich funktioniert mit Molekülen bis 10 kDa erprobt von L Quelle: CS - Compatible Solutes MSC - Mechanosensitive Kanäle

37 Eigenschaften des CS Ectoin in der Kosmetik

38 Ectoin ist Bestandteil der Salben der Marktführer
Beispiele für die Nutzung dieses neuesten Produktes am Markt Ectoin ist Bestandteil der Salben der Marktführer Shiseido Kanebo Sebamed Marbert Dadosens

39 Leben im Weltall? Es gibt “nach heutiger Erkenntnis” 3 Anforderungen für Leben: Wasser Energie Kohlenstoff Astrobiologen suchen gegenwärtig Leben auf dem Mars, dem Jupiter Mond Europa und dem Saturn Mond Titan Solches Leben sollte unseren Extremophilen ähnlich sein, weil es extremer Kälte, Drücken und Trockenheit widerstehen muss. “Schlammlawinen” wurden auf dem Mars gefunden (links). Diese könnten durch Wasserabgänge verursacht sein. Psychrophile könnten dort noch existieren.

40 Leben im Weltall? Europa soll eine Eiskruste haben, die einen 30-Meilen tiefen Ozean umgibt. Die rötlichen Sprünge im Eis werden als Hinweise auf Leben gesehen. Der Mond Titan ist von einem dunstigen Gas umgeben, das organische Moleküle wie Methan enthalten soll. Das könnte die Basis für Leben auf der Titanoberfläche liefern.

41 Leben im Weltall? Links ist ein 3,6 Milliarden Jahre alter Meteorit vom Mars zu sehen, den man in der Antarktis gefunden hat. Man fand in ihm merkwürdige Bakterien-ähnliche Strukturen, die allerdings sehr klein sind (ca nm). Auf der Erde sind nur die Mycoplasmen derart klein. Man vermutet auf dem Mars damals eine ähnliche Atmosphäre wie auf der Erde. Denkbar wären Mikroorganismen wie die Cyanobakterien, die Wissenschaftler sind sich jedoch nicht einig.

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43 Indeed, we may not be alone
Leben im Weltall? Meteorite enthalten Amino säuren und einfache Zucker. Wichtige Bausteine für Leben. Meteorite können als “Transporter”dienen um Lebenskeime im Universum zu verteilen. Eine probe von stratospherischer Luft zeigt ein bakterielle Diversität 41 km über der Erdoberfläche. (Lloyd, Harris, & Narlikar, 2001) Indeed, we may not be alone

44 Kleines Pepetitorium:
Was charakterisiert Extremophile und warum sind sie technologisch besonders interessant? Welche Abwehrmechnanismen hat die Natur gegen Salzbelastungen entwickelt? Nennen Sie Vor- und Nachteile. Welche Besonderheiten der Halophilen haben technisches Interesse erregt und warum?

45 Empfehlungen für weiteres Lesen
Zur Vertiefung der Vorlesung: Madigan TM: Brock Mikrobiologie, Spektrumverlag Heidelberg Berlin ISBN Margesin R, Schinner F (2001) Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles 5:73-83 Mehr Details: Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press ISBN Oren A (1999) Bioenergetic aspects of holophilism. Microbiology and Molecular Biological Reviews. 63: Madern D, Ebel C, Zaccai G (2000) Halophilic adaptation of enzymes. Extremophiles (2000) 4:91-98

46 Fragen ?