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01.11.10 – Extremophile Mikroorganismen – interessante Biokatalysatoren? 08.11.10 – Aufarbeitung und Bioprozessführung – getauscht mit A. Zehnsdorfer.

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2 – Extremophile Mikroorganismen – interessante Biokatalysatoren? – Aufarbeitung und Bioprozessführung – getauscht mit A. Zehnsdorfer Von der gläsernen zur maßgeschneiderten Zelle? Thermodynamik zellularer Prozesse VL Reihe – „Weiße Biotechnologie“ Beiträge der AG Maskow

3 Extremophile Mikroorganismen – interessante Biokatalysatoren? Stand:

4 Für Anfragen und Anregungen : PD Dr. Thomas Maskow Helmholtzzentrum für Umweltforschung - UFZ Department Umweltmikrobiologie Permoserstr Tel.0341/ Fax:0341/

5 Inhalt: Warum sind extremophile Mikroorganismen interessant ? Quellen extremophiler Mikroorganismen Pheno- und genotypische Besonderheiten Technische Bedeutung extremophiler Mikroorganismen Potential extremophiler Mikroorganismen und Ausblick

6 We teach microbiology But we learn from microbes

7 Das versteckte Potenzial der Mikroorganismen: Die Zahl der prokaryotischen Zellen 6,000,000,000,000,000,000,000,000,000,000 (6 x ) 50% des Weltkohlenstoffes, 90% des Stickstoffs und Phosphors, sowie 10 8 Spezies. 1 Gramm Boden < 10 9 Bakterien mit – Spezies. Stammsammlungen beinhalten < 10 5 Spezies > 90% manchmal >99% der Spezies einer Umweltprobe sind noch nicht kultivierbar. Versteckte Diversität von Pilzen + Protisten kaum untersucht. E. coli etwa 2000 metabolische Reaktionen Gewaltiges Synthesepotenzial  technische Anwendungen !!!

8 Extremophile (überleben unter „lebensfeindlichen“ Bedingungen) ResistenzmechanismenBesondere ProdukteAutosteriles Arbeiten Extremozyme Temperatur – v R Halotolerant – C(Edukt, Produkt) pH – Waschmittelzusätze Protektormoleküle Sterilität – Kostenfaktor biotechnologischer Verfahren

9 Quelle:

10 Quellen (Habitate) extremophiler Mikroorganismen

11 Extremophile:: Hyperthermophile (- 105°C) Psychrophile (-7 – 15 o C) Halophile (- Sättigung) Acidophile (- pH 0,5) Alkaliphile (- pH 11) Baro- oder Piezophile (> 800 atm) Tiefsee Bauwerke Heiße Quellen Sodaseen/-wüsten Gletscher Tiefsee Salzseen

12 Nutzung von Extremophilen HYPERTHERMOPHILE (Quelle)Nutzen DNA polymerase DNA amplification by PCR Alkaline phosphatase Diagnostic Proteasen und Lipasen Milch produkte Lipasen, pullulanases and proteasesDetergentien Proteasen Bäckerei und Brauerei, Aminosäure produktion aus Keratin Alkoholdehydrogenase Chemische Synthesen Xylanases Papierbleiche S-layer proteine und Lipide Molekulare Siebe Oil abbauende Mikroorganismen Surfactants für die Ölgewinnung Schwefeloxidierende Bakterien Bioleaching, Kohle & Abgas Entschwefelung Hyperthermophilic consortia Abfallbehandlung und Methan- produktion

13 PSYCHROPHILE Nutzen Alkaline phosphatasenMolekularbiologie Proteasen, LipasenDetergentien, Zellulasen und Amylasen Lipasen und ProteasenKäseherstellung und Milchverarbeitung ProteasenReinigungslösung für Kontaktlinsen Ungesättigte FettsäurenNahrungsmittelergänzung, Diätzusätze b-galactosidasenLaktose Hydrolyse in Milchprodukten Ice nucleating proteinsKünstlicher Schnee, Eiskrem Ice minus microorganismsFrostschutz für empfindliche Pflanzen Verschiedene Enzyme Bioremediation, Biosensoren (e.g. oxidases) MethanogeneMethanproduktion

14 ALKALIPHILE (Quelle)Nutzen Proteasen, Cellulasen, Xylanasen, Detergentien Lipasen and Pullulanasen ProteasenGelatine Entfernung von Röntgenfilmen Elastasen, KeritinasenEnthaarung CyclodextrineLebensmittel, Transport und Schutz von Wirkstoffen, Enantiomerentrennung, Pharmazie Alkaliphile HalophileÖlgewinnung Verschiedene MikroorganismenAntibiotika ACIDOPHILE (Quelle)Nutzen Schwefel oxidierende Metallgewinnung und Entschwefelung von Mikroorganismen Kohle MikroorganismenOrganische Säuren und Lösemittel

15 Alkohol dehydrogenase Alkohol dehydrogenase (ADH) von der Archaea Sulfolobus solfataricus Arbeitet unter harschen (vulkanischen) Bedingungen 88°C (fast siedendes Wasser), pH= 2 – 3.5 (Schwefelsäure- konzentrationen wie in Autobatterien) ADH katalysiert die Konversion unterschiedlicher Alkohole und hat erhebliches biotechnologisches Potential wegen seiner besonderen Stabilität

16 Halo- und osmophile Mikroorganismen

17 Extrem durch niedrige Wasseraktivitäten WasseraktivitätHabitatBewohner 1.000Reines H 2 OCaulobacter, Spirillum 0.995Menschliches BlutStreptococcus, Escherichia 0.980MeerwasserPseudomonas, Vibria 0.800Marmelade, ObstkuchenPenicillum 0.750Gesalzener Fisch, SalzseenHalobacterium, Halococcus 0.700Getreide, TrockenobstXerophile Pilze 1 g gereinigtes Meersalz enthält 10 6 Mikroorganismen !!! Wasseraktivität beeinflusst durch: Salze Zucker Wassermangel Halotolerant/-phil Osmophil Xerophil

18 Halotolerant oder Halophil ? Tolerieren höhere Salzgehalte, sind aber nicht darauf angewiesen NaCl-GehaltBezeichnung 1 – 6 %Schwach halophil 6 – 15 %Moderat halophil > 15 %Extrem halophil

19 Salzsee Südrussland, Luftbildaufnahme Quelle von Halophilen

20 Sodaseen: Etoscha-Pfanne, Namibia

21 Künstliche Habitate: Salzgewinnung aus Meerwasser Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press

22 Trockene Oberflächen

23 Resistenzmechanismen Salt – in StrategieCompatible-Solute Strategie Osmotisches Gegengewicht: K+K+ Kleine, organische Moleküle; Kompatibel zum Metabolismus (Compatible Solutes) Nachteil:Benötigt spezielle, salz- tolerante Enzyme Energetische Kosten der Synthese von Compatible Solutes Vertreter:aerobe extrem halophile Archea, Halobacteriales anaerobe extrem halophile Archea, Haloanaerobiales Vertreter aus allen 3 Domänen des Lebens Archea Bacteria Eucarya Vorteil:Standard-Enzyme „kostet“ wenig Energie; Na + /H + Antiporter; 1:2 - 2:3 primäre Na+ Pumpen

24 Bisherige technische Anwendungen  Habitat Quelle für Carotinoide (Bacterioruberine) als Nahrungsergänzungs- mittel, -färbemittel Produzenten während der Fermentation von Sojasoße und Thaifischsoße Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press

25 Halophile Enzyme Widerstehen hohen Ionenstärken Interessant für hohe ionische Edukt-/ Poduktkonzentrationen

26 Halophile dihydrofolat Reductase des Aarchaeon Haloferax volcanii, isoliert aus dem Toten Meer Einzigartige molekulare Struktur (aktiv, stabil und löslich bei hohen Ionenstärken) Hoher Anteil saurer AS Kleiner Anteil hydrophober AS viele Salzbrücken Aber: noch vieles unbekannt

27 Vergleich der dihydrofolat Reductase Halophilnicht-halophil

28 Anwendungen Viele mögliche Anwendungen von Halophilen werden untersucht: –Erdölextraktion –Gentechnischer Einbau halophiler Enzyme in Pflanzen um die Salztoleranz zu steigern. –Behandlung von Abwässern.

29 Bacteriorhodopsin Physiologische Funktion: Licht grüner Spektralbereich 570 nm - protonenmotorische Kraft Arbeitsweise: Ändert Protonisierung/Farbe in 10 ms -> technische Anwendungen pumpt ein Proton pro Photon

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31 Technisches Potential von BR folgt aus Licht ->Signal zu wandeln: Ladungstrennung Farbänderung Technische Anwendungen: Elektrostatische Energie -> photovoltaische Zelle Prototyp: 5-10 Jahre Während der Lichtspeicherung ändert BR die Farben Lichtmodulatoren Hochauflösende Displays Prototyp entwickelt Genetische Techniken helfen: Variation der Lebensdauer der Zustände Anregungswellenlänge Grundlage für 3D Speicher extrem kleiner Größe (1 Molekül reicht), hoher Speicherkapazität pro Volumeneinheit BewegungssensorenPrototypen entwickelt künstliche Netzhaut Prototypen entwickelt Licht -> elektrisches Signal -> Photozelle

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33 Primär osmotisches Gegengewicht aber auch generelle Schutzfunktion! Compatible Solutes – Protektormoleküle ! Schützen: Enzyme, biologische Strukturen aber auch ganze Zellen gegen: Hohe Ionenstärken Trockenheiten Hohe Temperaturen Niedrige Temperaturen Gefrieren Denaturierende Lösemittel UV-Strahlung

34 Ursachen der generellen Schutzfunktion? Preferential exclusion theory: Unterstützen die Wasserstruktur Arakawa, T und Timascheff SN (1985) The stabilisation of proteins by osmolytes. Biophys. J. 47: Suenobu K, Nagaoka M (1998) Ab into molecular orbital study on molecular and hydration structure of ectoine. J. Phys. Chem. A 102: CS verstärken hydrophobe Kräfte CS wirken der Entfaltung von Proteinen entgegen Compatible Solutes – Protektormoleküle !

35 Compatible Solutes: Struktur -> Funktion ? Anderer Typen: Dimethylsulfoniumpropionat Vom Polyoltyp: GlycerolMannitol Vom Kohlenhydrattyp: Sucrose Trehalose Vom Aminosäuretyp: EctoinProlin Glycinbetain CH 2 OH CH CH OH OH CHOH CHOH CH 2 OH O OH OH OH O CH 2 OH O OH OH CH 2 OH HOH 2 C

36 Welche Compatible Solutes kommen woher? MikroorganimusCompatible Solutes Nichtphototrophe, grampositive BakterienGlycinbetain, Prolin Nichtphototrophe, gramnegative BakterienGlutamat Süßwasser-CyanobakterienSaccharose, Trehalose Marine CyanobakterienGlycosylglycerin Marine AlgenMannit, verschiedene Glykoside, Prolin, Dimethylsulfonpropionat Salzsee-CyanobakterienGlycinbetain Halophile anoxygene phototrophe Bakterien Glycinbetain, Ectoin, Trehalose Extrem halophile ArcheaKCl Halophile Grünalge DunaliellaGlycerin Xerophile HefenGlycerin Xerophile fadenförmige PilzeGlycerin

37 Bakterienmelken 1. Phase (Wachstum und Synthese) Wachstum und Ectoinbildung in Gegenwart hoher Ionenstärken Quelle: Vorzüge: 3-4 Zyklen möglich funktioniert mit Molekülen bis 10 kDa erprobt von L 2. Phase (Produktabtrennung) Biomasse angereichert cross-flow Filtration. hypoosmotischen Shock -> Freisetzung der CS durch die MSC. Zelllyse findet nicht statt, hohe Produktreinheit Biomasse wird angereichert, CS im Permeat 3. Phase (Synthese) Auffüllen mit hochkonzentrierter Salzlösung, Synthese von CS CS - Compatible Solutes MSC - Mechanosensitive Kanäle

38 Eigenschaften des CS Ectoin in der Kosmetik

39 Beispiele für die Nutzung dieses neuesten Produktes am Markt Ectoin ist Bestandteil der Salben der Marktführer Shiseido Kanebo Sebamed Marbert Dadosens

40 Es gibt “nach heutiger Erkenntnis” 3 Anforderungen für Leben: Wasser Energie Kohlenstoff Astrobiologen suchen gegenwärtig Leben auf dem Mars, dem Jupiter Mond Europa und dem Saturn Mond Titan Solches Leben sollte unseren Extremophilen ähnlich sein, weil es extremer Kälte, Drücken und Trockenheit widerstehen muss. “Schlammlawinen” wurden auf dem Mars gefunden (links). Diese könnten durch Wasserabgänge verursacht sein. Psychrophile könnten dort noch existieren. Leben im Weltall?

41 Europa soll eine Eiskruste haben, die einen 30-Meilen tiefen Ozean umgibt. Die rötlichen Sprünge im Eis werden als Hinweise auf Leben gesehen. Der Mond Titan ist von einem dunstigen Gas umgeben, das organische Moleküle wie Methan enthalten soll. Das könnte die Basis für Leben auf der Titanoberfläche liefern.

42 Leben im Weltall? Links ist ein 3,6 Milliarden Jahre alter Meteorit vom Mars zu sehen, den man in der Antarktis gefunden hat. Man fand in ihm merkwürdige Bakterien-ähnliche Strukturen, die allerdings sehr klein sind (ca nm). Auf der Erde sind nur die Mycoplasmen derart klein. Man vermutet auf dem Mars damals eine ähnliche Atmosphäre wie auf der Erde. Denkbar wären Mikroorganismen wie die Cyanobakterien, die Wissenschaftler sind sich jedoch nicht einig. Mycoplasmen

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44 Meteorite enthalten Amino säuren und einfache Zucker. Wichtige Bausteine für Leben. Meteorite können als “Transporter”dienen um Lebenskeime im Universum zu verteilen. Eine probe von stratospherischer Luft zeigt ein bakterielle Diversität 41 km über der Erdoberfläche. (Lloyd, Harris, & Narlikar, 2001) Indeed, we may not be alone Leben im Weltall?

45 Kleines Pepetitorium: Was charakterisiert Extremophile und warum sind sie technologisch besonders interessant? Welche Abwehrmechnanismen hat die Natur gegen Salzbelastungen entwickelt? Nennen Sie Vor- und Nachteile. Welche Besonderheiten der Halophilen haben technisches Interesse erregt und warum?

46 Empfehlungen für weiteres Lesen Zur Vertiefung der Vorlesung: Madigan TM: Brock Mikrobiologie, Spektrumverlag Heidelberg Berlin ISBN Margesin R, Schinner F (2001) Potential of halotolerant and halophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles 5:73-83 Mehr Details: Oren A (2002) Halophilic microorganisms and their environment. Klywer Academic Press ISBN Oren A (1999) Bioenergetic aspects of holophilism. Microbiology and Molecular Biological Reviews. 63: Madern D, Ebel C, Zaccai G (2000) Halophilic adaptation of enzymes. Extremophiles (2000) 4:91-98

47 Fragen ?


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