MANNALABS Dr. Dr. Flaig Rűdiger & MA Lange-Flaig Irén.

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1 MANNALABS Dr. Dr. Flaig Rűdiger & MA Lange-Flaig Irén

2 Märkte Nahrung Milliarden- $-Markt Futter Milliarden- $-Markt Fuels Milliarden- $-Markt Öko Milliarden- $-Markt

3 Ein Produkt für alle Transgene Pflanzen Nahrung Milliarden- $-Markt Futter Milliarden- $-Markt Fuels Milliarden- $-Markt Öko Milliarden- $-Markt

4 Unsere Technologie «FURLAC» DE 102007053992.6 PCT/EP20008/009596 «HIMBEER» DE102008038937.4 «YOGI» DE102008064223.1. Abzweigungen weltweiter Markt Transgene Pflanzen Nahrung Milliarden- $-Markt Futter Milliarden- $-Markt Fuels Milliarden- $-Markt Öko Milliarden- $-Markt

5 Zu lösende Probleme Die globale Energieversorgung ist kritisch. Fossile Brennstoffe (Kohle, Öl, Gas) sind begrenzt. Regenerative Energien sind ungenügend verfügbar. Kernenergie ist politisch inakzeptabel. Biofuels sind nur dann eine Alternative, wenn sie nicht die Nahrungsproduktion gefährden. Ohne Treibstoff ist Großlandwirtschaft unmöglich. Qualität und Quantität des Ackerlands sinken. Unterernährung und Hunger betreffen Millionen. Übermäßige Landwirtschaft verschlimmert die Lage. Süßwasser wird immer knapper. Die Weltbevölkerung wächst weiter. Durch Industrialisierung steigt der Pro-Kopf-Bedarf.

6 Daher wird etwas benötigt, das......sowohl Nahrung/Futter als auch Treibstoff liefern kann, um die wachsende Nachfrage einer wachsenden Bevölkerung zu befriedigen,...kein Ackerland benötigt und daher mit herkömmlicher Landwirtschaft verträglich ist,...zum «Umweltschutz» im weitesten Sinn beiträgt, einschließlich von Bodenamelioration,...Salzwasser verträgt und daher den Süßwasserverbrauch nicht weiter steigert,...idealerweise die verschiedenartigsten Umweltbedingungen verträgt.

7 Die Märkte (1) Nahrung & Viehfutter in Zusammenhang mit unseren Patenten: Beliebige Pflanzen können verwendet werden Zum direkten menschlichen Verzehr geeignet Auch als Viehfutter verwendbar Gesteigertes Wachstum ohne Stickstoffdünger Keine Auslaugung der Böden; bei Verwendung von Wasserpflanzen wie Algen oder Wasserlinsen wird kein Ackerland benötigt Salzresistent und stresstolerant Können somit zu einer nachhaltigen Steigerung der Produktivität der weltweiten Landwirtschaft dienen Die Weltbevölkerung könnte mittels der hier beschriebenen Pflanzen ernährt werden Große Nettogewinne aus Lizenzgebühren für die weltweite Verwendung der Produkte

8 Die Märkte (2) Biotreibstoff mit unseren Patenten: Erheblich höhere Produktivität als mit herkömmlichen Biotreibstoffpflanzen Keine Konkurrenz zur Nahrungs- und Futter- produktion: Bislang ungenutzte Flächen können verwendet werden Aus geeigneten Pflanzen wie der an Kohlenwasser- stoffen (Carotinen) reichen Alge Hæmatococcus können Treibstoffe billiger raffiniert werden Der Weltenergiebedarf könnte mittels der hier be- schriebenen Pflanzen gedeckt werden Große Nettogewinne aus Lizenz- gebühren für die weltweite Ver- wendung der Produkte

9 Die Märkte (3) «Öko»: Eine große Zahl umweltbezogener Anwendungen ist möglich, darunter: CO 2 -Sequestration zur Bekämpfung des Klimawandels; Emissionsminimierung bei Kraftwerken Abscheidung niedermolekularer Silikate aus Abwässern und Bildung von Phyllosilikaten zur Bodenverbesserung Besetzung natürlicher Lebensräume zur Bekämpfung von Schadorganismen (z. B. Abdeckung von Wasser- flächen zur Bekämpfung von Malariamücken) Entfernung von öligen Verschmutzungen aus Böden und Gewässern Große Nettogewinne aus Lizenzgebühren für die weltweite Verwendung verschiedener Produkte

10 Die Märkte (4) Andere Anwendungen: Für die näheren Details sehen Sie die Anmeldung Nr.PCT/EP2008/009596, die die bislang beanspruchten Anwendungsmöglichkeiten im Detail auflistet Davon einige Beispiele von kleinerer Bedeutung: Herstellung von Papier, Pappe und Zellstoff Expression pharmaceutisch wertvoller Proteine Produktion von Zuckern, «Bioplastik» etc. Schädlingsbekämpfung Es können darüber hinausgehende Anwendungen entwickelt werden.

11 Investitionssicherheit Das Projekt umfasst mehrere neue Techno- logien («Furlac», «Himbeer», «Yogi», etc.). Jede dieser neuen Technologien kann auf unterschiedliche Weisen genutzt werden (siehe «Abzweigungen und Nebenprodukte»). Die meisten Nutzungen (z.B. Nahrung, Energie) werden global benötigt und werden dies voraussichtlich auch weiterhin. Selbst wenn einzelne Technologien und/oder Anwendungen nicht die Erwartungen erfüllen, gibt es immer noch genügend Marktnischen, um das Projekt zu einem wirtschaftlichen Erfolg zu machen.

12 Im Rösselsprung Boden- amelioration Papier, Zucker, Bioplastik Abwasserbehandlung Schädlings- bekämpfung Nahrung & FutterTreibstoffe CO 2 -Sequestration Auflösung von Schwerölkon- taminationen

13 Kernprojekt: «Furlac» Verbesserung des Pflanzenwachstums – Gesteigerte Nutzung des Sonnenlichts Unabhängigkeit von Düngemittel – Nutzung atmosphärischen Stickstoffs Resistenz gegen Salzwasser – Salz muss aus den Zellen hinausgepumpt werden Umweltsicherheit: Begrenzung des maxi- malen Wachstums – Eingebaute Vergreisung

14 Kernprojekt: «Furlac» Verbesserung des Pflanzenwachstums Gesteigerte Nutzung des Sonnenlichts Unabhängigkeit von Düngemittel Nutzung atmosphärischen Stickstoffs Resistenz gegen Salzwasser Salz muss aus den Zellen hinausgepumpt werden Sicherheit: Begrenzung des maximalen Wachstums Eingebaute Vergreisung Benötigt für effektives Arbeiten

15 Verbesserte Lichtnutzung (1) Pflanzen nutzen nur 4% des einfallenden Lichts ja In den Chloroplasten wird nur rotes und blaues Licht absorbiert, grünes wird reflektiert ja FRET (Foerster Resonance Energy Transfer): Direkte Energieübertragung zwischen fluores- zierenden Substanzen dank dieses physikali- schen Phänomens ja Eine das energiereiche grüne Licht des Sonnenlichts absorbierende fluoreszierende Substanz in den Chloroplasten könnte diesen Bedreich nutzen helfen, indem sie es in den Chlorophyll weiterleitet.

16 Verbesserte Lichtnutzung (2) Nobelpreis 1999 (Blobel): Wie man Proteine an Orte in der Zelle lenkt Jedes Protein kann jetzt in die Chloroplasten gesteuert werden Nobelpreis 2008 (Chalfie): Fluoreszkáló proteinek einige absorbieren gelbes bis grünes Licht und können es an Chlorophyll weiterreichen Zusammen lösen diese beiden Entdeckungen des Problem in wesentlichen Feinheiten durch «YOGI» abgedeckt

17 Unabhängigkeit von Kunstdünger Enzyme, die atmosphärischen Stickstoff binden, sind bekannt, aber benötigen viel Energie und sind sauerstoffempfindlich Dieses Plus an Energie wird durch verbesserte Lichtnutzung bereitgestellt Die Enzyme werden an sauerstoffarme Orte in der Zelle «geblobelt» (Mitochondrien) Feinheiten ebenfalls durch die «YOGI- Technologie» abgedeckt

18 Verträglichkeit von Salzwasser Enzyme, die Salz aus den Zellen hinauspumpen, sind bekannt (z. B. aus der menschlichen Niere), aber benötigen viel Energie. Die Mehrenergie wird durch verbesserte Licht- nutzung bereitgestellt.

19 Eingebaute Vergreisung In Abwesenheit des Enzyms Telome- rase ist das Zellwachstum begrenzt, und die Zellen vergreisen. Man stelle deswegen die zelleigene Telomerase unter externe Kontrolle (z. B. mit Bujards TET- System), was einen doppelten Vorteil ergibt: Keine Gefahr, dass die Biosphäre von den transgenen Pflanzen überwachsen werden Kunden (Landwirte) können die Pflanzen nicht illegal weiterzüchten

20 Was ist zu tun? Teil A: Konstruktion eines Gens für Fluoreszenz im Chloroplasten und Einbringen in eine Pflanzenzelle => Energie Teil B: Konstruktion eines Gens für mitochon-driale Nitrogenase und Einbringen in eine Pflanzenzelle => Stickstoff Teil C: Einbringen eines Gens für eine Salzpumpe in eine Pflanzenzelle=> Kompatibilität mit Salzwasser Teil D: Ersatz der pflanzlichen Telomerase durch regulierte Telomerase => Sicherheit für Machbarkeitsbeweis noch nicht erforderlich!

21 Einheiten des Projekts (I) - Kernprojekt: umfasst Teile A, B, C und D «YOGI-Technologie» kann nötig sein (II) - Erweiterungen: umfasst Teile E, F und G (weiter unten) «YOGI-Technologie» unverzichtbar (III) - Abzweigungen und Nebenprodukte: interessante individuelle Anwendungen weitere «Extras» sind nach Rücksprache mit den Geldgebern und interessierten Dritten zu vereinbaren

22 Interessante Pflanzen Wir entwickeln am Modell einzelliger, mikro- skopischer Modellorganismen, die jedoch eben- falls bereits von wirtschaftlichem Nutzen sind: Chlorella Hæmatococcus Nach dem Machbarkeitsbeweis werden die Ergebnisse auf Wasserlinsen übertragen oder auf beliebige andere interessante Pflanzen (einschl. Mais, Raps, Soja etc.)

23 Dimensionen der Arbeit (1) Jeder der vier Teile ist etwa mit einer Diplom- arbeit vergleichbar. Was funktioniert, das funktioniert. Es gibt in der Biologie keine Skalierungsprobleme. Im besten Fall könnte jeder Teil innerhalb eines Monats abgearbeitet werden. J Jeder Teil ist an sich einfach, aber es kann Probleme geben. Zur Lösung haben wir die mächtige «YOGI-Techno- logie» entworfen. Ihre Umsetzung erfordert jedoch Geld und Arbeit. Eine konservativere Zeitplanung ist ratsamer: Je 10 Monate für A, B und C + 4 Monate Aufbau Machbarkeitsbeweis für A+B nach 24 Monaten.

24 Dimensionen der Arbeit (2) Abgesehen von unserer Forschungsarbeit, erfordern biologische Systeme generell sehr viel Routinearbeit: 60 – 70% der Arbeit sind Laborantenarbeit: Erhaltung von Zellkulturen und Pflanzen Herstellung von Lösungen, Medien und anderem Material Pflege der Laborausrüstung 10 – 20% sind für Laborhilfen Reinigung der Laborausstattung Abfallentsorgung Andere Hilfsdienste Ausreichend Personal ist unverzichtbar: für Kernprojekt: min. + 3 Laboranten + 1 Hilfe vorzugsweise: + 6 Laboranten + 2 Hilfen, doch je mehr, desto besser! (Schneller Entwicklung spart Zeit und führt zu besserer Amortisierung.)

25 Dimensionen der Arbeit (3) Unsere Patente: «Furlac» (PCT/EP2008/009596) – kommt im Sommer 2010 in die nationale / regionale Phase: Übersetzungen zerfällt in ein Bündel nationaler/regionaler Anmeldungen Fortführung in allen PCT-Ländern erforderlich «Yogi»: internationale Nachanmeldung ist im Sommer 2009 einzureichen PCT + Lateinamerika, Taiwán &c. Marken, Sorten und andere Schutzrechte: noch einzureichen Einzelprodukte später individuell zu schützen.

26 Benötigte Qualifikationen Laboranten – ausgebildete Fachkräfte: Geeignet: Biolaboranten, Chemielaboranten, xTAs (Biologisch-Technische, Medizinisch-Technische, Pharmazeutisch-Technische usw. Assistenten) Laborhilfen – ungelernte Kräfte: werden an Ort und Stelle eingewiesen; Laborerfahrung ist von Vorteil Akademiker: ILF & RMF sind der wissenschaftlichen Arbeit gewachsen organisatorisch-kaufmännisch-rechtliche Hilfestellung allerdings ist willkommen evtl. anfänglich zusätzliche Leute zur Erfüllung rechtlicher Auflagen formal notwendig?

27 Zeitrahmen Geplanter Beginn: April 2010 (?) Start der Entwicklung: August 2010 (?) Wir fangen mit den Teilen A+B an andere Teile (einschl. «YOGI») parallel, wenn Personal und Mittel dafür verfügbar sind. 1. Etappe: April 2012 Machbarkeitsnachweis für die Teile A+B spätestens jetzt mit den Teilen C+D beginnen Entscheidung über Zusatzteile (E, F, G). 2. Etappe: April 2013 Kernprojekt abgeschlossen (einschl. Machbarkeit für C+D) andere Teile in Abhängigkeit von Personal und Finanzmitteln Evaluation des Fortschritts bei den Zusatzteilen.

28 Abzweigungen & Nebenprodukte Verschiedene Anwendungen der Pflanzen: Essen, Futter, Treibstoff wie oben erwähnt Technische Systeme enhaltend diese Pflanzen: Kläranlagen Emissionsfreie Kraftwerke Weitere Anwendungen der Technologie: z. B. «YOGI» zur Untersuchung molekularer Interaktionen: Kommerziell verwertbare Enzyme Therapeutika und Diagnostika Schnellbehandlung emergenter Krankheiten (Ebola & Co.) Bezahlbare personalisierte Therapie (Krebs) mit DE102007005191.5: Arzneimitteltransportsystem mit DE102007005192.3: evtl. Behandlung entzündlicher und degenerativer Erkrankungen

29 Wie geht die Arbeit vonstatten? Molekularbiologische Arbeit besteht hauptsächlich aus dem folgenden Zyklus: DNA-Sequenzen bereitstellen optional: Modifizieren Zusammensetzen Überprüfen Massenproduktion in Bakterien Einbringen in den Zielorganismus Beobachtung und Auswertung der Ergebnisse Modifikation und nächster Zyklus – bis die gewünschten Ergebnisse erreicht worden sind Hierauf basieren Arbeitsabläufe und Ausrüstung.

30 Bereitstellung von Sequenzen Sequenzdaten aus Datenbanken Computer & Internet Synthesen werden als Aufträge vergeben Isolation von DNA/RNA aus Organismen allgemeine Laborausstattung PCR (Polymerasekettenreaktion) Thermocycler, Polymerase & Co. Antikörpersequenzen aus Hybridomen werden als Aufträge vergeben «YOGI» Liposomenherstellung, Zetasizer, Facsort

31 Arbeit an Sequenzen PCR Thermocycler Restriktion («Schneiden») Restriktionsenzyme Ligation («Kleben») Ligase Überprüfen: Elektrophorese und Sequenzierung Elektrophoreseapparatur Sequenzierung wird als Auftrag vergeben alternativ (großes Arbeitsvolumen, z.B. bei «YOGI»): Sequencer

32 DNA-Massenproduktion Bacterienkulture Brutschränke Kulturenschüttler Präparation Sorvall/Beckman-Zentrifuge Tischzentrifuge Qiagen-Kits Überprüfung Elektrophorese und Sequenzierung

33 In den Zielorganismus Transfektion von Pflanzenzellen: Elektroporation (Huang et al. 2006) alternativ: «Genkanone» (Biolistic) Achtung: Kann u.U. Waffenschein erforderlich machen! Selektion genetisch modifizierter Zellen Chemische Selektion Selektion nach Fluoreszenz: Facsort Weitere Charakterisierung Fluoreszenzmikroskop mit Kamera

34 Haltung der Zielorganismen Brutschränkte und Kulturenschüttler mit Beleuchtung Lichtmessgerät Mikroskop mit Neubauer-Kammer Coulter-Counter Autoklav

35 Andere Notwendigkeitn Bibliothekszugang Kooperation mit Universität/Firmen für spezialisierte Analysen und Synthesen Allgemeine Laborausstattung detaillierte Liste liegt bei Müllentsorgung alles biologische Material kann sterilisiert und als normaler Müll entsorgt werden Unterbringung

36 Genemigungen und Gefahren Erforderliche Betriebsgenehmigung: Biosicherheit S1 (niedrigste Stufe) Projektleitergenehmigung (Dr. Dr. Flaig hat sie) Geringe Mengen an Laborchemikalien Keine «immissionen» oder größere Müllproduktion, keine explosiven Stoffe, kein biogefährlicher Abfall Noch andere Genehmigungen? - Ungarischen Rechtsexperten konsultieren!

37 Erweiterungen Teil E: Silikatpolymerisation Entfernung niedermolekularer Silikate aus Abwässern (verhindert Diatomeenblüten) Bildung von Phyllosilicaten zur Verbesserung des Rückhaltevermögens von Böden Teil F: Amphipile Peptide und Oxidasen Sekretion detergenzienartiger Peptide und oxidierender Enzyme Auflösung, Oxidation und Auffressen von Ölverschmutzungen Teil G: «Himbeer» Isolation von Resitenzdeterminanten aus Tardigraden Erzeugung von Pflanzen mit extremer Resistenz gegenüber Hitze, Kälte und Dürre

38 Glossar (1) PCR: Verfahren zur Vervielfältigung und/oder Modification eines DNA-Stücks Erfordert Thermocycler und Reagenzien Thermocycler: Gerät zum zyklischen Erhitzen und Abkühlen von Proben für die PCR - 3000,- Liposomen: mikroskopische blasenartige Strukturen für YOGI erfordern LiposoFast- oder LIPEX-Gerät zur Herstellung und Zetasizer bzw. Facsort zur Messung Preise nur auf Anfrage (avestin@avestin.com)

39 Glossar (2) Zetasizer: Gerät zur Bestimmung von Größe und Oberflächenladung von Liposomen oder ähnlichen Partikeln - 2500,- Coulter-Counter: Gerät zum Zählen und zur Größenmessung von Zellen - 4000,- (Ebay: 500,-) Mikroskope: 2× Inversmikroskop für die Zellkultur - 2× 1500,- Fluoreszenzmikroskop mit Kamera - 5000,- Facsort: Gerät zur Messung und Sortierung von Zellen und Liposomen nach Größe und Fluoreszenz - 50'000,- mit Sortierfunktion, 30'000,- ohne

40 Glossar (3) Zentrifugen: für jede Art von Fällungen erforderlich zwei Varianten: Tischzentrifuge – 3× 1500,- Groß und gekühlt – 2× 3000,- Elektrophorese: Auftrennung von Makromolekülen nach Größe zwei Varianten, jeweils aus zahlreichen Einzelteilen: für Proteine – 1000,- gesamt für DNA – 1000,- gesamt Autoklav: zur Sterilisation - 1000,-

41 Glossar (4) Enzyme: Molekulare Werkzeuge Polymerase: bildet DNA Restriktionsenzyme: schneiden DNA Ligase: klebt DNA Brutschränke und Kulturenschüttler: erforderlich zur Haltung von Mikroorganismen - 3000,- für Gesamtsatz müssen mit Beleuchtung ausgestattet werden – hiermit werden lokale Handwerker beauftragt Qiagen: Kits zur Isolation von DNA aus Bakterien Sequencer: zur Bestimmung von DNA-Sequenzen - 5000,-

42 Glossar (5) Elektroporation: zwingt DNA in Zellen zur Schaffung transgener Organismen mittels eines elektrischen Schlags Benötigt Elektroporator - 2000,- Biolistic: «Genkanone» - Alternative zur Elektroporation, schießt Mikroprojektile in die Zellen - 8000,- Rechtlicher Status?? Neubauerkammer: Zubehör zu Mikroskopen zur Zählung - 50,- Möbel und Kleingeräte: separat aufgelistet