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Quantenphysik in Lebens- (und) medizinischen) Wissenschaften Péter Maróti Professor für Biophysik, Universität von Szeged, Ungarn. Grundlagen der Lumineszenz.

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1 Quantenphysik in Lebens- (und) medizinischen) Wissenschaften Péter Maróti Professor für Biophysik, Universität von Szeged, Ungarn. Grundlagen der Lumineszenz (Absorption- und Fluoreszenzspektroskopie) Lehrbücher: Biophysik für Mediziner (Herausgeber S. Damjanovich, J. Fidy und J. Szöllősi) Medicina, Budapest, Fercher A.F. Medizinische Physik, Springer, Wien, New York Haas U. Physik für Pharmazeuten und Mediziner; Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH. Suttgart Maróti P., Laczkó G.: Bevezetés a biofizikába, JATEPress, Szeged 1998 (Ungarisch) P. Maróti, L. Berkes, F. Tölgyesi: Biophysics Problems. A Textbook with Answers. Akadémiai Kiadó, Budapest 1998 (Englisch). Besuchen Sie für die weiteren Enzeilheiten das „Homepage” des Instituts auf englischen und ungarischen Sprachen.

2 Welche Faktore bestimmen die Lichtabsorption der Moleküle? Symmetrie und Überlappung der Elektronenbahne und die Multiplizität der Spine. (Von der Chemie zu der Spektroskopie der Moleküle; Erfrischung der Kentnisse aus Chemie) Elektronenenergie der Moleküle

3 Molekülorbitale, Energieniveaus und Elektronenübergänge Formaldehyd Energiezustände der Elektronenbahne Nichtbindende Orbitale der angeregten Zustände BEISPIEL

4 , n und  * Orbitale Formaldehyd 1e- H: 1s 6e- C: 1s 2 2s 2 2p x 2p y 1s 2 (2sp 2 ) 3 2p z 1 8e- O: 1s 2 2s 2 2p y 2 2p x 2 1s 2 (2sp 2 ) 5 2p z 1 Angeregter Zustand Grundzustand Angeregter Zustand  ** n  -  * n -  * 2p z (C) + 2p z (O) ** Carey, Organic Chemistry, 1987

5 Energieniveaus, Besetzung und Übergänge im Formaldehyd Anregung Internale Konversion Zurück zum Grundzustand

6 Elektron-, Vibration- und Rotationsenergien des Moleküls at room temperature Grundzustand Elektron Anregungs energie Anharmonischer Oszillator Wellenfunktion Übergang Enegrieniveaus der Vibration Rotationsenergie Vibrationsenergie Elektronenenergie Besetzung bei Zimmertemperatur Die Energieniveaus der Rotation sind so klein und dicht, dass man sie in diesem Maß nicht darstellen kann. E Molekül = E Elektron + E Vibration + E Rotation

7 Die Elektronübergänge sind viel schneller (~10 15 s -1 ), als die Kernschwingungen (~10 13 s -1 ). Das hat bestimmte Folgerungen, die man im Franck- Condon Prinzip zusammenfassen kann. Franck-Condon Prinzip Elektronübergänge im zweiatomaren Molekül Die Koordinate des Atomkerns Kernschwingung Der Atomkern ist in „Ruhe” Elektronübergang

8 Franck-Condon Prinzip: Entstehen der Fluoreszenz Folgerung des Energieerhaltungssatzes : Stokes’sche Verschiebung Fluoreszenz Relaxation Absorption Chlorofill

9 Lumineszenz: Fluoreszenz + Phosphoreszenz Thermische Relaxation Internale Konversion Absorption Phosphoreszenz Spiegelsymmetrie Stokes-Verschiebung Rote Verschiebung Die wichtigsten Prozesse (Fluoreszenz, Löschung der Fluoreszenz, Transfer der Anregungsenergie, chemische Reaktionen, usw.) beginnen vom ersten Anregungszustand des Elektrons. Übergang zwischen Singlet- Triplet Systeme

10 Absorptionsspektroskopie

11 Spektrophotometrie Definitionen, Grundgrößen und das Beer-Lambert’sche Gesetz Transmission (Durchlässigkeit): Optische Dichte (Absorbance): Beer-Lambert’sches Gesetz: wo: I 0 und I sind die Intensitäte des einfallenden bzw. durchgelassenen Lichtes, c: ist die Konzentration der Lösung (mol/L = M), l : ist die optische Weglänge (Lichtweg) in der Lösung (Schichtdicke in cm), ε: molarischer Absorptionskoeffizient (M -1 ·cm -1 ) I0I0 I l l

12 Spektrophotometer Rotierender Sektor mit Kreisausschnitt Photoelektronen- vervielfacher oder Halbleiter (pin) Photodiode Lichtquelle: Glühlampe, Xe-Lampe, usw. I0I0 I Monokromator Probe Referenz

13 Photometrie der Haut dermis epidermis subcutaneous Schicht erythema (Hautröte) Photo-carcinogenesis Pigmentbildung Verbrennungsschaden

14 Die Untersuchung der Umgebung der Chromophorgruppen mit Hilfe der Absorptionsspektralphotometrie Farbstoffe des Sehens: die Familie des Rhodopsins Blaue Verschiebung Angeregter Zustand Grundzustand Rote Verschiebung Stimmung

15 Stäbchen: schwarz/weiß Sehen Zapfen: Farbensehen Licht Z apfen St äbchen Retinen

16 rot empfindlich grün sensitiv blue empfindlich Wellenlänge (nm) Absorption Stäbchen Zapfen Der Kern der Zelle Synapse Membransystem mit Farbstoff/Protein Komplex Rhodopsin Die Absorptionsspektra von Rhodopsin Entscheidende Frage: Sind chemisch verschiedene Chromophore in Retinal oder es gibt nur ein Chromophor in Retinal aber es steht in verschiedenen Wechselwirkungen mit der Umgebung?

17 Rhodopsin Die Pigmente der Stäbchen die für das Sehen kleiner Lichtintensität verantwortlich sind: max = 500 nm Ein ähnliches Farbstoff/Protein -Komplex in Zapfen, das für das Farbsehen verantwortlich ist : max = 414 nm (blau) max = 533 nm (grün) max = 560 nm (rot) Das Chromophor ist identisch in allen Komplexen: 11-cis retinal und das spektrale Feinstimmen ist durch Wechselwirkung mit der Umgebung gewährleistet. Biochem (2001) 40,

18 Das Absorptionsspektrum von Rhodopsin in Sehzellen (Stäbchen und Zapfen) in der Membran von Retinal Blauer Zapfen Grüner Zapfen Roter Zapfen Stäbchen Relatíve Absorption

19 11-cis retinal all trans retinal h Lichtinduzierte Konformationsänderungen von Retinal (chemisches Isomerism)

20 Proteinstruktur von Rhodopsin in der Umgebung des Chromophors Biochem (2001) 40, Protonierbare Schiff’sche Base

21 Aminosäure, die verantwortlich sind um die Verschiebung des Absorptionsspektrums von Rhodopsin bei Mutation Biochem (2001) 40, Transmembranes Helix

22 WT: 500 nm G90S: 487 nm T118A: 484 nm E122D: 477 nm A292S: 489 nm A295S: 498 nm T/E/A dreifache Mutation 453 nm Aminosäure, die um die blaue Verschiebung des Absorptionsspektrums von Rhodopsin verantwortlich sind Biochem (2001) 40, Blaue Verschiebung T/E/A Wellenlänge wilder Typ, keine Mutation

23 Wechselwirkende Dipole der Chromophore. Drei einfache Anordnung der Geometrie. I. „Spiel Karten” Geometrie II. „Kopf-Schwanz” Geometrie III. „Gräte” Geometrie AA  Die schwingenden elektromagnetischen Dipole sind mit Federn dargestellt. Harmonische Schwingung AA AA  

24 I. „Spiel Karten” Geometrie Verschiebung nach blue  Assoziationen monomer A dimer AA polymer Monomer Dimer Polymer S1S1 S0S0 f2f2f0 E und ff2·f2·f0 Stärke des Oszillators: In Phasein entgegengesetzter Phase schwingen die Oszillatoren.

25 II. „Kopf-Schwanz” Geometrie Monomer Dimer f2·f0 E Rote Verschiebung  Monomer Dimer + und Stärke des Oszillators ff2·f2·f0 in Phasein entgegengesetzter Phase gestattet, und niedrigere Energie (rote Verschiebung) nicht gestattet (verboten) und blaue Verschiebung

26 III. „Gräte” Geometrie Monomer Dimer E  Monomer Dimer Davydov’sche (Exciton-) Spaltung in Phase Große Energie Gestattete Übergänge In entgegengesetzter Phase Niedrige Energie Gestattete Übergänge ff Σ f ≠ 0 Stärke des Oszillators

27 Molekularkomplexe können Verschiebung im Absorptionsspektrum verursachen. Beispiel: Antocyanin Komplexe Diese Komplexe geben die Farbe der Blüten und Früchte (Obstsorten) und ihre Absorptionsspektra bedecken den ganzen sichtbaren Spekralbereich anthos + kyanos = Blume + blau

28 Exciton Bände sind oft verantwortlich um die verschiedenen Farben der Blüte und Früchte: Antocyanin Komplexe entstehen, die mit nichtkovalenten Hidrogenbindungen zusammengehalten sind. Die Zusammensetzung des Komplexes „Commelinin”: 6 Antocyanin (A/blau) és 6 Flavocommelin (F/gelb) PNAS (2001)98,

29 Modell: synthetisches Komplex aus Dimelamin und Barbituat PNAS (2001)98,

30 Komplex (10 -3 M) kein Komplex (10 -6 M) Mit Verdünnung, das Komplex zerfällt (dissoziert) und verändert sich seine Farbe: eine Bandverschiebung erfolgt im Absorptionsspektrum PNAS (2001)98, Achtung: ISOSBESTISCHER PUNKT Alle Spektra laufen durch einen gemeinsamen Punkt Das Komplex zeigt eine „Spiel Karten” Geometrie: mit fortwährender Ausbildung des Komplexes mit zunehmender Konzentration, das Spektrum verschiebt sich nach BLAU.

31 Bakteriochlorophyll Dimer: Davydov (Exciton) Spaltung im roten Band des Absorptionsspektrums JACS 88:2681 (1996) grünes Fenster blaues (Soret) Band rotes Band in 1/(M·cm)

32 UV Absorptionsbände der  * Übergänge von Purinbase und Pyrimidinbase Die Vektordipole der  * Übergänge der Purinbase und Pyrimidinbase liegen in der Ebene der aromatischen Ringe Berechnete Bände

33 Hyper- und Hypochromie Der Elektronenübergang im Molekül „A” steht in Wechselwirkung mit den (kleineren oder größeren) Energieübergängen des benachbarten Moleküls „B”. AB AA BB Das Ergebnis der Wechselwirkung: die Stärken der Oszillatoren können vergrößert oder verkleinert werden. HyperchromieHypochromie A B

34 Summationsregel nach Kuhn und Thomas + Die Gesamtfläche unter der Absorptionskurve ist konstant. + Das Ergebnis der strengen Anornung ist die Verringerung der Intensität des nahen UV Bandes aber gleichzeitig erhöht sich die Intensität des fernen UV Bandes.  Die molekularen Wechselwirkungen können die verschiedenen Bände steigern oder verringern, aber die gesamte Fläche des Absorptionsspektrums bleibt unverändert. Beispiel: das Hyperchromie der Nukleinsäure

35 Ein Beispiel für das Hypochromie Die sinkende Absorption bei 260 nm kommt von der annehmenden Anordnung der DNS und RNS Molekülen. Geordnete DNS mit zwei Ketten Ungeordnete DNS mit einer Kette Mononukleotiden Absorption Wellenlänge (nm)

36 Anwendung des Hypochromie: Befolgung des Schmelzens der zweifädigen DNS (E. coli) mit Hilfe der Absorption bei 260 nm. Die native DNS hat kleinere Absorption bei 260 nm. DNS mit zwei Ketten (niedrige Temperatur) DNS mit einer Kette (hohe Temperatur) Temperatur ( o C) Relative Absorption, A denat /A nat (260 nm)

37 Fluoreszenzspektroskopie

38 S2S2 S1S1 S0S ’ 1’ 2’ 0’’ 1’’ 2’’ Akzeptor Molekül 0 IC FABS PHOTOC HEM Q Energie- übergabe IX P T1T1 Die Emission der Fluoreszenz und ihre Konkurrenzprozesse ABS = Absorption Q = Löschung IC = Innere Konversion IX = Konversion unter Systemen F = Fluoreszenz P = Phosphoreszenz PHOTOCHEM = Photochemie

39 S2S2 S1S1 S0S ’ 1’ 2’ 0’’ 1’’ 2’’ 0 Absorption Innerhalb ungefähr 10 ps = s alle Moleküle erreichen das Vibrationsniveau des ersten Anregungszustandes der Elektronen, das zu der Zimmertemperatur entspricht s: innere Konversion; die „heiße” Moleküle geben die extra Wärmeenergie der Umgebung (der Lösung) ab s: die charakteristische Zeit, die das angeregte Molekül zur Relaxation (zum Rückkehr zu dem Grundzustand) braucht. Wärme Licht Wärme

40 S2S2 S1S1 S0S ’ 1’ 2’ 0’’ 1’’ 2’’ 0 Absorption T1T1 Phosphoreszenz: Emission von Photonen von dem untersten angeregten Triplettzustand (die Spinpaare der Elektronen haben die gleiche Richtung) s: innere Konversion s: Übergang unter verschiedenen Systemen; Umdrehen des Spins im angeregten Zustand, Singulett → Triplett Übergang Fluoreszenz Phosphoreszenz s: Triplett → Singulett Transfer + Relaxation Wärme

41 k I (für alle übrige Übergänge) kfkf Was können wir aus der Fluoreszenz lernen? (1) Molekulare Zusammenstöße (Löschung der Fluoreszenz) (2) Transfer der Anregungsenergie der Elektronen (3) Ralaxation des Lösungsmittels (4) Rotation des Chromophors Erreichbarkeit des betreffenden Moleküls Molekularabstände Polarität des Lösungsmittels Molekularmaß und Viskosität

42 (1) k abs : - Absorption, die mit der Oszillatorstärke (f ) proportional ist. - Ein sehr schnelles Prozess in der Größenornung von s -1 (2) Innere Konversion (IC): - Thermische Relaxation im singuletten Energiesystem - Strahlungloser Übergang: die Energie wird durch Zusammenstoß den Lösungsmittelmolekülen übergegeben. k IC  s -1 S2S2 S1S1 S0S0 ε: molare Absorption, c: Lichtgeschwindigkeit (in cm/s), m e : Masse des Elektrons (g), e: elektrische Ladung des Elektrons in CGS Einheit (esu), n: Brechzahl des mediums und N 0 : Avogadro’sche Zahl.

43 (3) Fluoreszenz: k f  10 8 s -1 die spontane Emission des Lichtes (4) Ereignisse die zum Zusammenstoß gebunden sind: Löschung: Zusammenstoß mit Löschungsmolekülen Entstehen von Excimer: ein Molekül im Grundzustand (X) stößt mit einem anderen Molekül im angeregten Zustand (X * ) zusammen, und ein Komplex entsteht (XX) *, das wesentlich verschiedene Emissionseigenschaften besitzt als das originale Molekül. S2S2 S1S1 S0S0

44 Zusammenstöße X X* Angeregter Zusatand mit Lebensdauer von ~10 -8 s hνhν (1) Dynamische Löschung: X* + Q X + Q + Wärme kQkQ Zusammenstoß im angeregten Zustand: zuerst Photon Absorption und erst dann Zusammenstoß Statische Löschung: X + Q XQ K eq X* Fluoreszenz hh (XQ)* keine Fluoreszenz Grundzustandskomplex: zuerst Zusammenstoß (und Komplex- ausbildung) und erst dann Photon Absorption hh (2) Ausbildung von Excimer: X* + Y (XY)* Fluoreszenz Komplex aus angeregtem Zustand: nach der Photonabsorption kann das Komplex entstehen.

45 Löschung der Fluoreszenz Dynamische Löschung: Zusammenstoß mit einem Molekül im angeregten Zustand k Q = bimolekularer Konstante der Rate von Fluoreszenzlöschung. X* Q 50Å 1. X + h  X* 3. X*  Q +h ’ kQkQ kfkf 2. X* + Q  X+Q+ Wärme SoSo S1S1 kfkf [Q]·k Q kIkI Weil das Lebensdauer von X* ist ~ 10 ns, X* wird sich mit einem Löschermolekül Q in dem Kugel von Radius 50 Å um X* sicherlich treffen. Die schnellsten Zusammenstöße sind durch Diffusion limitiert. Die Rate der Zusammenstöße ist: k Q ·[X*][Q] zwischen dem Molekül im Angeregtem Zustand X * und dem Löscher Q. k Q < M -1 s -1 Wenn [Q] = 1 M, dann jedes X* Molekül hat Zusammenstöße innerhalb 1 Sekunde. Absorption

46 Dynamische Löschung, die Stern-Volmer’sche Darstellung Stern-Volmer’sche Darstellung Kein Löscher: Φfo =Φfo = k f k f + k I + Löscher: Φ f = kfkf k f +k I +k Q· [Q] k Q [Q] k f + k I ΦfoΦfo ΦfΦf FoFo F kf kf k f + k I +k Q [Q] k f  == 1 + = 1 + k Q  o [Q] = 1 + K·[Q] FoFo F K = Stern-Volmer’sche Konstante k Q = Löschungskonstante FoFo F [Q] Steigung = K 1 2 SoSo S1S1 kfkf [Q]·k Q kIkI Das Verhältnis der Fluoreszenz- ausbeuten: Φ f : Fluoreszenz- ausbeute F: Intensität der Fluoreszenz

47 (5) Übergabe der Energie: k trans Singulett - Singulett oder F Ö rster X ist angeregt, und Y gibt Fluoreszenz R X*Y (6) Übergang unter Systemen: k IX ~ langsam, spin-verboten k IX (S 1 T 1 ) ~ 10 8 s -1 k IX (T 1 S 0 ) ~ 10 2 s -1 Die Raten ändern sich im breiten Bereich (7) Phosphoreszenz: k P Strahlender Übergang (T 1 S 0 ) : langsam und spin-verboten (von ms zu Minuten) Die Spektra von Phosphoreszenz sind relativ zu denen der Fluoreszenz nach dem roten Bereich verschoben. S0S0 S1S1 S2S2 k t = k f ·(R 0 /R) 6

48 (8) Photochemie: k CHEM Der Grund des Lebens auf der Erde. Die kovalenten Bindungen werden nach Lichtanregung umformen. Die besten biologischen Beispiele: - Retinal in Rhodopsin und in Bakterienrhodopsin Das Licht erzeugt cis-trans Isomerisation. Das ist der Anfangsschritt in bioenergetischen Prozessen wie das Sehen (Rhodopsin) oder die Protonpumpe (Bakteriorhodopsin). S0S0 S1S1 S2S2 - Die Reaktionszentrenproteine der photosynthetischen Organismen (grüne Pflanzen und Bakterien)

49 Eigenschaften und spezifische Anwendungen der Fluoreszenz 1. Spektra der Emission und der Excitation (Anregung) Polarität der lokalen Umgebung, Konzentration des Fluorophors, usw. 2. Quantenausbeute der Fluoreszenz Prozesse, die mit der Fluoreszenz in Wettbewerb stehen 3. Anisotropie (Polarization) der Emission (sehr wichtig, aber hier nicht behandelt) Rotationsdiffusion 4. Lebensdauer der Fluoreszenz (auch wichtig, aber hier nicht diskutiert) Dynamische Prozesse im Zeitbereich der Nanosekunde 1. Löschung der Fluoreszenz Erreichbarkeit des Lösungsmittels Eigenschaften der lokalen Umgebung 2. Förster’sche Resonanztransfer der Energie (FRET) Donor-Akzeptor Entfernungen und Orientierungen 3. Fluoreszenzmikroskopie, Zellseparator (hier nicht behandelt) Ortbestimmung und Separation 4. Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) Translations- und Rotationsdiffusion Konzentration Dynamik 5. Zurückgewinnen der Fluoreszenz nach Photoentfärbung (FRAP) Translations- und Rotationsdiffusion

50 Wellenlänge SPEKTRA DER FLUORESZENZ einiger Verbindungen (Farbstoffe) Relative Fluoreszenzintensität Quinin SulfatRhodamin Ethídium Bromid Fluoreszcein

51 Quinin Sulfat Ethídium BromidFluoreszcein Rhodamin

52 Drei Grundgesetze des Fluoreszenzspekrums 1.Invarianz Prinzip: Das Fluoreszenzspektrum der Lösung von chemisch homogenen Farbstoffen hängt nicht von der Wellenlänge des Anregungslichtes ab. 2.Stokes’sches Verschiebungsgesetz: Das Maximum des Fluoreszenzspektrums verschiebt sich nach dem Bereich der kleineren Energie (nach „rot”) relativ zu denem des Absorptionsspektrums. 3.Das Gesetz der Spiegelsymmetrie: Das Spektrum der Fluoreszenz ist (mit guter Näherung) das Spiegelbild des Absorptionsspektrums relativ zu der Achse der kleinsten Energie (Frequenz) der Absorption.  F 0-0’

53 Excitationsspektrum (Anregungsspektrum) der Fluoreszenz F ( Exc )   ( Abs ) Beispiel: 1-anilinonaphthalene-8- sulfonic Säure (1,8-ANS) Fluorophor in Ethanol. Die Wellenlänge der Fluoreszenz ist zur Beobachtung festgelegt und die Wellenlänge der Anregung ist verändert. So nimmt man das Anregungsspektrum der Fluoreszenz an. Wenn die drei Grundgesetze des Fluoreszenzspektrums gültig sind, dann das Anregungsspektrum der Fluoreszenz und das Absorptionsspektrum fallen zusammen. Es ist gültig für homogene Farbstoffe (siehe das Jablonski’sche Termschema).

54 Quantenausbeute der Fluoreszenz Die Definition der Quentenausbeute: Φ F =k f / (k f +k nr ), Absorption Emission kfkf k nr Grundzustand Angeregter Zustand Wärme

55 Die Übergabe der Excitationsenergie (Transfer der Anregungsenergie) h Anregung von „A” Die Elektronanregung wandert sich von „A” zu „B” A B k t = k f ·(R 0 /R) 6 kfkf Förster’sche Resonanz- Energietransfer bei R = R 0 (Förster’scher Radius) k t = k f „A” deaktiviert sich mit Hilfe von entweder Fluoreszenz, k f oder mit Energieübertragung (Energietransfer), k t Grundzustand Anregungszustand „B” aktiviert sich durch Energietransfer

56 Spezielles Messverfahren: Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) Die Fluktuation der Intensität der Fluoreszenz aus einem sehr kleinen Raumelement (≈ 1 Femtoliter, L) ist gemesst. Die Fluktuation kommt aus der veränderlichen Zahl der ein- bzw. austretenden Fluorophor Moleküle und sollte mit der Diffusionskonstante eng verbunden sein. Die Bewegung der Fluorophore ist schnell langsam in dem beobachteten Raumelement. Anregung emittiertes Photon Zeit

57 Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie (FCS) Die Autokorrelationsfunktion G(  ) kann man aus dem zeitlichen Verlauf der Intensität der Fluoreszenz F(t) berechnen: δF(t)=F(t)– mittlere Intensität tt + τ F(t)F(t)F(t + τ) δF(t) = F(t) - Abweichung von der mittleren Intensität

58 Einfaches Beispiel: Autokorrelationssfunktionen eines fluoreszierenden Ligands im freien Zustand und gebunden zu einem Protein. Freier Ligand (ist klein und diffundiert schnell) Der Ligand ist zu einem „faulen” Protein gebunden. Das Verhältnis des freien und gebundenen Ligands ist 1:1 G(  ) → 0 nach länger Zeit

59 Das Protein (sein Gen) ist von Aequorea victoria Medusen isoliert: T203Y: das Tyrosin ist mit  - Elektron zum aromatischen Ring des Chromophors gekoppelt und damit stabilisiert den angeregten Zustand und verschiebt die Fluoreszenz nach Rot. Die Maxima der gelben Fluoreszenz ist 529 nm, der blauen ist 448 nm und der cyanen ist 485 nm. Spektrale Stimmung: Umgebung des Proteins und Mutation Autokatalitische Reaktion von drei Aminosäure im Protein: Zyklisierung und Oxidation ausgelöst durch O 2 GFP Gün fluoreszierendes Protein

60 AK: Adenilat Kinase GFP Lösung GFP Zelle GFP-AK1 in Cytosol GFP-AK1b in Cytosol Autokorrelationsfunktionen von freien GFP und GFP gebunden zu AK AK1b-GFP Komplex in Cytoplasm und Membran der Zelle. Mehr als 1 Komponent (Diffusions- zeitkonstante)

61 Weitere spezielle Fluoreszenz-Messverfahren: Zurückgewinnen der Fluoreszenz nach Photoentfärbung, Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) 1. Es gebe ein Protein (z.B. GFP), das auch selbst Fluoreszenzlicht ausstrahlen kann. 2. Entfärben wir die fluoreszierenden Proteine in einem gegebenen Teil der Zelle durch starkes Laserlicht! Die Entfärbung ist endgültig (irreversible). 3. Messen wir die Intensität der Fluoreszenz aus diesem Gebiet der Zelle während intakte Proteine langsam eindiffundieren! Vor dem Blitz Feuer! Proteine diffundieren in das entfärbten Bereich. t0t0 t1t1 t2t2 E. coli Zelle Messung der Diffusion der Proteinen im Cytoplasm von E. Coli Bakterien.

62 Einzelne Zelle, die GFP produzieren kann. Entfärbung der Mitte der Zelle durch Laser, Zeitpunkt t 0 t = 0,37 s nach der Entfärbung t = 1,8 s nach der Entfärbung J. Bacteriology (1999) 181, Die Diffusion von GFP in intakten Zellen von E. coli 4 µm Die Invasion der intakten Moleküle durch Diffusion in das entfärbten Gebiet der Zelle. Ergebnisse: D = 7,7 µm 2 /s (7,7 · m 2 /s) Dieser Wert ist 11- mal kleiner als die Diffusionskonstante im Wasser: 87 µm 2 /sec. Die große Konzentration der Proteine im Cytoplasm ( mg/ml) ist verantwortlich für die langsame Diffusion in der Zelle („crowding”).

63 Fluoreszenzspektroskopie und SEX Science (2002) 295, 92 Weißes Licht UV Licht Die Fluoreszenz des Federkleides des Papagais ist ein Zeichen um das Geschlechtsinteresse zuerwecken.

64 Alarmreaktion der Tiefseemeduse Die Meduse betätigt ein Lichtrad mit Biolumineszenz um die Aufmerksamkeit des Raubfisches abzulenken.

65 Tiefseemeduse 2000 m unter der Oberfläche (in totaler Dunkelheit). Sie benutzt Biolumineszenz (als Köder) um Fische zuergreifen (Science, 2005.) Rote Biolumineszenz (sie wird nicht durch Lichtabsorption sondern durch chemische Reaktionen angeregt)

66 Hausaufgaben 1.Die Nukleinsäure haben ein starkes Absorptionsband bei 250 nm. Das Band zeigt eine (Davydov-sche) Exciton Spaltung von 5 nm in Polinukleotiden, weil die Wechselwirkung mit den Nachbaren sehr stark ist. Wie groß ist die Wechselwirkungsenergie in Einheiten von kJ/mol wenn die Bildung von bloß Dimeren angenommen ist? 2.Die Lebensdauer der Fluoreszenz eines Donors beträgt τ f = 2 ns in der Abwesenheit eines Akzeptors. Wie groß wird die tatsächliche (beobachtete) Lebensdauer in der Anwesenheit eines Akzeptors? Geben Sie die Lebensdauer des Donors in der Funktion der Konzentration des Akzeptors! Der Förster-Radius ist R 0 = 3 nm. 3.Bei einem Versuch des Auslöschens der Fluoreszenz, die Intensität der Fluoreszenz (F) änderte sich nach der Konzentration des Löschers ([Q]): Wie groß ist die Stern-Volmer-sche Konstante? [Q] (mM)01248 F (rel. Einheit)

67 Hausaufgaben 4. Je tiefer der Taucher im Wasser des Meeres sinkt, desto dunkler wird es sein. Nehmen wir an, dass der molarische Absorptionskoeffizient im sichtbaren Bereich des Spektrums 6,2· /(M·cm) ist. Bestimmen wir die Tiefe, wo der Taucher a) halbe Lichtintensität, b) ein Zehntel der Lichtintensität vergleichend am Oberfläche des Meeres beobachtet! 5. Bestimmen Sie den isosbestischen Punkt von zwei Stoffen (A und B) die gegenseitig Reaktante und Produkte sind, d.h. A ↔ B. Die Gleigewichtskonstante ist K eq, die Absorptionspektren sind Gauss-sche Funktionen mit Maximum Lagen von 500 nm bzw. 520 nm, Maximum Werten von 2·10 4 M -1 cm -1 bzw. 4·10 4 M -1 cm -1 und Breiten von 50 bzw. 70 nm für die zwei Stoffe.


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