Sandro Rusconi (9.3.52) UNIFR Rusconi 2006 Winterthur

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1 Sandro Rusconi (9.3.52) UNIFR Rusconi 2006 Winterthur 28. W'thurer Fortbildunkgskurs Primarschullehrer (Locarno, Switzerland) Diploma in Molekularbiologie UNI Zuerich PhD curriculum UNI Zuerich, molecular biology Oberassistent UNI Zuerich Postdoc UCSF, K Yamamoto, (San Francisco) Group leader, UNI Zuerich, PD oggi Ordentliche professor Biochemie UNI Fribourg Direktor Swiss National Research Program 37 'Somatic Gene Therapy' Sabbatical, Tufts Med. School Boston and Univ. Milano, Pharmacology Department Präsident Union of Swiss Societies for Experimental Biology (USGEB) Euregenethy Network (EU-harmonsiation of biosafety and ethical aspects in gene therapy) Sportdoping mittels Gentransfer: relistisch oder nur virtuell? Direktor Divisione Cultura e Studi Universitari Cantone Ticino a a a a a a

2 Aspekte die behandelt werden
UNIFR Rusconi 2006 Ziele und methoden der Therapie mittels Gentransfer ('Gentherapie') Gene, Prinzipien, Vektoren, Methoden Wo stehen wir mit Gentherapie? Erfolge und Misserfolge einer 15-jährigen Geschichte Quintessenz Lesen sie vor allem im diesen orange Box Wieso ist Gentransfer attraktiv für den Doping? Erwartungen insbezug auf Leistung und Tarnung Welche konkrete Möglichkeiten gäbe es fuer Gendoping? Praktische Perspektiven, Hürde, Detektionsmöglichkeiten, Nebeneffekte, Risiko-Nutzen Bilanz Schlussfolgerungen Gendoping ist noch im sehr unreifem Zustand, trotzdem bewegt sich jemand in dieser Richtung a a a a a a

3 Abschnitt 1: Konzepte UNIFR 2006 Gewebe, Zellen, Genen
Rusconi 2006 Gewebe, Zellen, Genen Genfunktion, Genmanipulation Was ist eigentlich einen Gen? Was man sich vorstellt und was realisierbar ist mit Dentransfer a a a a a a

4 1 Organismus -> 1013 Zellen (10'000'000'000'000
1 Organismus -> 1013 Zellen (10'000'000'000'000!!!), in spezialisierten Gewebe und Organe UNIFR Rusconi 2006 2m 2 mm 0.2mm 0.02mm Ergo in 1 cm3 -> 1'000'000'000 Zellen um Gentransfer zu erzielen muss man neue DNA Molekuele in den Zellkerne dieser Zellen einschleusen 0.001mm DNA RNA Protein a a a a a a

5 Das Motto: 'ein Gen = eine Funktion' ist definitiv veraltet
UNIFR Rusconi 2006 DNA GENE RNA(s) Protein(s) 2-5 FUNCTIONS Gene expression Transcription / translation Ergo: die Nebeneffekte eines Gentransfers koennten viel weiter gehen als man sich von den bekannten Funktionen sich vorstellen darf a a a a a a

6 Aber, was ist eigentlich ein Gen
Aber, was ist eigentlich ein Gen?: ein Segment von Erbinformation die durch eine Nanomachine interpretiert wird UNIFR Rusconi 2006 RNA DNA Protein GENE FUNCTION Transcription / translation Um die Rolle zu leisten, muss einen DNA Segment folgende Signale beinhalten RNA Transkription (qualitativ und quantitativ) RNA Maturatuion RNA Translation (Uebersetzung in eiweisse) RNA Abbau Dilemma: wie kann man alles in einem verkuerzten DNA Stück einpacken? DNA RNA spacer regulatory coding spacer a a a a a a

7 Was man sich vorstellt und was ist eigentlich machbar im Bereich humaner Gentransfer?
UNIFR Rusconi 2006 gesellschaftliches Mythos der Gentechnik Genmanipulationen werden die Schaffung von gezielt konstruierte transgene Monster-Armeen erlauben Ergo das gilt auch für Gendoping. Fuer die Nächste Jahren müssen wir keine transgene Athleten erwarten. Aber somatisch veränderte Sportler sind wohl im Bereich des Machbares. Realität Die Schaffung transgene Menschen (mit erbbaren, artifiziellen Genveränderungen) steht noch weit Man 'begnügt' sich mit somatischem Gentransfer (nicht permanent und nicht erbbar) a a a a a a

8 Abschnitt 2: Somatische Gentherapie (SGT)
UNIFR Rusconi 2006 Definition und Anwendungen Unterschiede zur konventionellen Therapie Wieso 'somatisch'? Anatomische Gentransfer-Wege a a a a a a

9 Somatische Gentherapie (SGT): Definitionen und Anwendungen
UNIFR Rusconi 2006 efinition von SGT: 'Gene als Medikamente anwenden': Behandlung von Krankheiten mittels Gentransfer Chronische Behandlung Akute Behandlung Vorbeugende Behandlung NFP37 somatic gene therapy Erbkrankheiten Erworbene Krankheiten Loss-of-function Gain-of-function a a a a a a

10 Pharmakologische Betrachtungen des DNA Transfers
UNIFR Rusconi 2006 Konventionelle Medikamente Protein Medikamente DNA als Medikament Mw Daltons Synthetically prepared Rapid diffusion/action Oral delivery possible Cellular delivery: - act at cell surface - permeate cell membrane - imported through channels Can be delivered as soluble molecules Ångstrom/nm size rapidly reversible treatment Mw 20 ’  ’000 Da Biologically prepared Slower diffusion/action Oral delivery not possible Cellular delivery: - act extracellularly Can be delivered as soluble molecules nm size rapidly reversible treatment Mw N x 1’000’000 Da Biologically prepared Slow diffusion Oral delivery inconceivable Cellular delivery: - no membrane translocation - no nuclear translocation - no biological import Must be delivered as complex carrier particles nm size slowly or not reversible O H O H O O H O O H O O H O O H Therapie mittels DNA braucht spezielle formulierung des Materials (Vektoren) ist viel komplizierter als konventionelle verabreichung ist viel weniger reversibel als konventionelle pharmakologische Therapie O a a a a a a

11 Wieso 'somatisch ' ? UNIFR Ergo:
Rusconi 2003 UNIFR Rusconi 2006 Ergo: somatische Gentherapie berürht die Keimzellen NICHT Die Veränderung ist nicht erbbar Keimzellen: die Zellen die für die Vermehrung des Organismus notwendig sind Solmatische Zellen: alle andere Zellen des Körpers a a a a a a

12 Die drei anatomische Hauptwege fuer den Gentransfer:
UNIFR Rusconi 2006 Ex-vivo In-vivo lokale Verabreichung In-vivo systemische Verab. Ergo die ex-vivo und die lokale in-vivo Routen sind heute bevorzugt V Beispiele: - Knochenmark - LeberZellen - HautZellen Beispiele: - Gehirn - Muskeln - Auge - Gelenke - Tumoren Beispiele: - Intravenös - intra-arteriell - intra-peritoneal a a a a a a

13 Abschnitt 3: Vektoren für Gentransfer
UNIFR Rusconi 2006 Die zwei Klassen: viral und nicht-viral Beispiele der Unterschiede Mini-liste der gängigen Vektoren Limitierungen der gängigen Vektoren a a a a a a

14 Zwei Klassen von SGT Vektoren: Viral bzw Nicht-Viral
UNIFR Rusconi 2006 non viral gene transfer (transfection) A Wieso sind Viren bessere Vektoren? viel effizienter! nicht virakle systeme haben folgende Hürde noch nicht überschritten: - Stabilität im Blut - Spezifisches Andocken - Vermeidung des intrazellulären Abbau - Transfer im Zellkern - Integration ins Wirtsgenom - Anti-apoptotische Funktionen - Tarnung gegenüber dem Immunsystem - ... B Nuclear envelope barrier! viral gene transfer (Infection) direct nuclear shuttling! a a a a a a

15 Praktisches Beispiel: Transfer eines Reporter-Gens mit Transfektion (= nicht viral) oder Infektion (= Viral) UNIFR Rusconi 2006 Transfection Zellen inkubiert mit 1'000'000 r-DNA/cell während 12 Stunden Infection Zellen inkubiert mit 3 r-virus/cell während 30 min Ergo Gentransfer mit viralen vektoren ist millionenfach effizienter als nicht viraler Gentransfer a a a a a a

16 Mini-liste der gängigen Vektoren für Gentransfer
UNIFR Rusconi 2006 r-Adenovirus r- Adeno-associated V. r- Retrovirus r- Lentivirus Naked DNA Liposomes & Co. Oligonucleotides RNAi Ergo aber erinnern wir daran: "nobody is perfect..." a a a a a a

17 Limitierungen der gängigen SGT Vektoren
UNIFR Rusconi 2006 r-Adenovirus - no persistence - limited packaging - toxizität immunogenizität Biolistic bombardment or local direct injection - limited area r-AAV - no integration in host g. - very limited packaging - autoimmunität? Electroporation - limited organ access Liposomes, gene correction & Co. - rather inefficient transfer r-Retrovirus (incl. HIV) - limited packaging - zufälliger Insertion - unstable genome In generale - ineffizienter transfer - Seltene integration ins Wirtsgenom In generale - Immunantwort - limitierte Verpackungsraum - Stillegung der Expression - Ineffizienz der Produktion Ergo in die Zukunft werden synthetische Partikeln viele Virale Funktionen integrieren Solutions: - improved liposomes with viral properties (“Virosomes”) Solutions: - synthetic viruses (“Virosomes”) a a a a a a

18 Abschnitt 4: der langsame Fortschritt der Gentherapie
UNIFR Rusconi 2006 Klinische Versuche der letzten 15 Jahren Erfolge und Meilensteine Dokumentierte Nebeneffekte a a a a a a

19 15 jahre Gentherapie in der Klinik
UNIFR Rusconi 2006 40 60 100 20 80 trials 500 1500 1000 patients 1992 1994 1996 1998 1990 2000 cancer Ergo Trotz intensiver Forschung hat weniger als 2% der SGT Versuche Phase III erreicht Januar 2006: 1030 cumulative protocols 5300 treated /enrolled patients I I-II II 66% phase I 19% phase I-II 13% phase II 0.8% phase II-III 1.7% phase III Ausnahmen (China!) Jan :Gendicine, by Sibiono Inc. 2004, in Cina behandelte patienten in 2004, >50'000 in 2005? Nov :H101, by Shanghai Sunway biotech, in Cina. Unbekannte Angaben. hered. vasc. 20% overall still pending or not yet Initiated ! Infect. a a a a a a

20 Einige Meilensteine (auch wenn meistens nur in Phase I)
UNIFR Rusconi 2006 1990, 1993, 2000, // ADA deficiency F Anderson, M Blaese 90/93/ C Bordignon 2000/2004 Anderson, 1990 Bordignon, 2000 (ESGT, Stockholm) 2002, science 296, 2410 ff) Isner, 1998 Fischer, 2000 2002 Kirn, 2000, 2001 2002 2003 Intravascular adenoviral agents in cancer patients: Lessons from clinical trials (review) dropped in 2004? licensed China 2005? 1997, 2000, Critical limb ischemia J Isner, I Baumgartner, 1998 Manuel Grez Hans Peter Hossle Reinhard Seger 2004/2005 very encouraging data from just initiated clinical trial, prospected >10 patients 25 Leben klar gerettet dank Gentherapie ~200 Leben Qualitätsverbessert ~nnn Leben gerettet oder verbessert in China mit Gendicine oder H101 ? Gendicine (approved China 2004) -> ! Hum Gene Ther 16, 1016 ff. H101 (approved in China, 2005) Sibiono Shenzen 2000, Hemophilia M Kay, K High 2000, 2002, X-SCID A Fischer, 2000/2002, Thrasher 2003 2001, 2003 ONYX oncolytic Viruses D Kirn (Cancer Gene Ther 9, p ) 2004, Chronic Granulomatous Disease M Grez Frankfurt; R Seger Zürich 2004/2005 Gendicine (adeno-p53 vector) L Peng, Sibiono Inc, Shenzen, China a a a a a a

21 Die meist befürchtete Nebeneffekte der SGT
UNIFR Rusconi 2005 Immunantwort zum Vektor Immunantwort gegenüber dem Frenden Gen allgemeine Toxizität der viralen Vektoren Verunreinigungen in den viralen Vektor-Präparate zufälliger Integratikon ins Wirtsgenoms, -> erhötes Tumor-Risiko Verunreingung des Genoms von Keimzellen Ergo Die Illusion der 90er Jahren ist verdunstet ZUstand der technologie ist noch unreif Indikation beschchränkt sich auf tödliche oder sonst schwere Krankheiten a a a a a a

22 Beispiele von Nebeneffekte 1: Von Pennsylvania bis Paris
UNIFR Rusconi 2006 NY May 5, 1995, R. Crystal: adenovirus, cystic fibrosis (lung) one patient mild pneumonia-like condition Trial interrupted and many others on hold. UPenn, Sept. 19, 1999, J. Wilson: adenovirus , OTC deficiency (liver) one patient (Jesse Gelsinger) died of a severe septic shock. Many trials were put on hold for several months (years). Paris, Oct 2, 2002, A Fischer: retrovirus , x-SCID (bone marrow) one patient developed a leukemia-like condition. Trial suspended and some trials in US and Germany on hold until 2003. Paris, Jan 14, 2003, A Fischer: retrovirus X-SCID (bone marrow) same cohort a second patient developed a similar leukemia 30 trials in USA were temporarily suspended Ergo SGT kann unter dem heutigen Technologischen Zustand Schwere Nebeneffekte verursachen Paris, Jan 24, 2005, A Fischer: retrovirus X-SCID (bone marrow) same cohort a third patient developed a similar leukemia a a a a a a

23 Beispiele von Nebeneffekte 2: Autoimmunität gegen EPO in experimentelle Affen
UNIFR Rusconi 2005 Blood (2004), Vol. 103, No. 9, comment: pp Autoimmunity in EPO gene transfer (macaques) Els Verhoeyen and François-Loïc Cosset Papers: - Chenuaud and colleagues (page 3303) - Gao and colleagues (page 3300) inadvertent autoimmune response in nonhuman primates resulting from transfer of a gene encoding a self-antigen. - homologous EPO cDNA via AAV vectors - muscle or lung, - supra-physiologic serum levels of EPO Ergo Genexpression in den 'Falschen' Geweben führt zu detektierbaren Unterschiede in der Protein Faltung/Modifizierung Die Unterschiede können Autoimmunität auslösen Ein wichtiger Signal fuer alle die träumen sich mit EPO Gentransfer in den Muskeln zu dopen. K High, ASGT June meeting 2004 [Abstract1002] Immune Responses to AAV and to Factor IX in a Phase I Study of AAV-Mediated, Liver-Directed Gene Transfer for Hemophilia B a a a a a a

24 Abschnitt 5: Potential von Gentransfer für Dopingszwecke
UNIFR Rusconi 2006 Wieso bleibt es attraktiv? Auf welchen Niveaus dürfte es anwendbar sein? Welche Funktionen könnte man modulieren? Beispiel Tierversuche (Lee Sweeney) a a a a a a

25 Doping mittels Gentransfer = 'gene doping') :
Doping mittels Gentransfer = 'gene doping') : ...wieso bleibt es so faszinierend trotz den SGT Schwierigkeiten UNIFR Rusconi 2006 Gentherapie (Zusammenfassung) - Behandlung ist nicht erbbar - Anwendbar für jede Krankheitsklasse - Einige Vektoren wurden verbessert - Das prinzip hat in einigen Fällen funktioniert ...aber: - Noch nicht klinisch konsolidiert - Heutige Technologie beinhaltet viele Risiken - Pionierzustand Dann: was macht Gentransfer so attraktiv für Doping? - mystisches Glauben in der 'Macht der Gene' - erscheint 'natürlicher' als traditioneller D. - man stellt es sich als 'permanent' vor - man stellt es sich 'besser' als konventioneller D. - man meint es sei 'undetektierbar' Ergo: Obiektiv betrachtet, sollte Gentransfer nur zur Behandlung von schweren Krankheiten beschränkt bleiben. Trotzdem interessiert sich den Doping feld vermehrt fuer Gentransfer-Techniken a a a a a a

26 Welche Funktionen kommen in Frage als Gendoping-Ziele?
UNIFR Rusconi 2006 ex vivo, in hämatopoietische Gewebe: pro-hematopo. (Epo receptor, oxygen transport...) in vivo lokal (Beispiel Muskeln): metabolische Verstärker, Wachstumsfaktoren, Muskelfasern Modulatoren, Herzmodulatoredn (glucose/oxygen, MGF, IGF-1, anti-myostatin, Epo) in vivo lokal (beispiel gelenke und Sehne): Entzündungshemmer, Erholungsfaktoren, Reparaturfaktoren (anti-TNF, BMPs, ...) Ergo: Doping mittels Gentransfer hat vielfältige Anwendungsrichtungen in vivo systemisch: metabolische verstärker, Hormone, anti-Schmerzfaktoren (hormone metabolising enzymes, peptide hormones, proenkephalins, ...) a a a a a a

27 Die Tierexperimente von Lee Sweeney (2004) haben viel Staub aufgewirbelt...
UNIFR Rusconi 2006 Transfer IGF-1 Gen (J. App Physiol 96, 1097 ff (2004)) Das System IGF-1 -> growth factor for muscles AAV Vector, intra muscular Rat model , + or - training training: IGF-1: muscle force Die Resultate muscle force and muscle mass increased beyond levels obtained in training ... Hier sind unsere Fragen - Kann man es auf Menschen extrapolieren? - Kg Muskeln zum transformieren? - Wie kann man genügend Vektor herstellen? - Symmetrie der Effekte? - Wie steht es mit Nebeneffekte? Ergo ok, Dr. Sweeney, das gentransfer hat einige Resultate gebracht, aber... - - + + - - + + a a a a a a

28 Abschnitt 6: Gefahre und Limitierungen vom Gendoping
UNIFR Rusconi 2006 Welche spezifische Nebeneffekte darf man sich erwarten? Technische und objektive Limitierungen Entdeckungsmöglichkeiten Vergleich mit konventionellem Doping a a a a a a

29 Erwartete Nebeneffekte vom Gendoping
UNIFR Rusconi 2006 Mittel- und Kurzfristig Autoimmunität Hyperimmunität Toxischer Shock sport hunter jones.mov Langfristig Fibrose Tumoren Unzugänglichkeit zu spätere Gentherapie Besonders gefährlich: Rücksichtlosigkeit Ungeeignete Technik (niederes GCP Niveau) (ungeeigneter Vektor, geringe Kompetenz der Aerzte) Ungeeignetes Material (niederes GMP Niveau!) (pathogen oder pyrogen kontaminiert ) Ungenuegender follow-up a a a a a a

30 Weitere Limitierungen vom Gendoping
UNIFR Rusconi 2006 Gentransfer mit viralen Vektoren wieder-verabreiching blockiert allgemeine und geno-Toxizität Gentransfer mit nicht-viralen Vektoren allgemein ineffizient keine oder geringe Nachhaltung Ergo: Risiken und Hürden scheinen höher als die Nutzen Weitere, Strategie-unabhängige Probleme Aufwendige und kaum zugängliche Technologie Langfristige Erhaltung der Genexpression ist schwierig Geringe Rückgängigkeit Unsymmetrie der Effekte (bei lokaler Verabreichung) a a a a a a

31 Entdeckungsmöglichkeiten vom Gendoping
UNIFR Rusconi 2006 Entdeckungstechnologien Antibody detection (viral antigens) r-nucleic acids detection (PCR) recombinant protein / post-translational modification detection (MALDI-TOF , IEF, ELISA) Ergo Fremde Gen-reste darf man nur kurzfristig nach Gentransfer in Koerperflüssigkeiten aufspüren Fremde Gensequenzen sind aber langfristig in Geweben detektierbar Abnormale Produkte (inkorrekt prozessierte Eiweisse) koennen entstehen und sind detektierbar Aenderung einiger Reglemente zur Detektion und Sanktion? Die Schwierigkeiten Anatomically difficult to detect (if locally administered) -> but leaves permanent genetic marking Detection of nucleic acids cannot be easily performed in body fluids (except in early phase) -> might require specific tissue biopsy a a a a a a

32 Vorteile und Nachteile vomGD im Vergleich zum konventionellen Doping
UNIFR Rusconi 2006 Kategorie Drug/protein Gene-based Ergo: die Chancen sind theoretisch ziemlich alle gegen die Gendoping-Option Geschwindigkeit schnell langsam Aber: das obige braucht gesunder Menschenverstand, eine seltene Eigenschaft im Doping-Feld (siehe Veterinärprodukte oder klinisch ungetestete Produkte auf dem Dopingmarkt) Rückgangigkeit schnell Langsam Dosierung einfach schwierig Komplexitätsniveau tief hoch verbundene Risiken je nachdem hoch Tarnung möglich schwierig a a a a a a

33 Abschnitt 7: Schlussfolgerungen und Perspektiven
UNIFR Rusconi 2006 Kurzantworte an komplexe Fragen Danksagung a a a a a a

34 Schlussfolgerungen zum Gendoping: (Plakative Kurzantworte zu FAQ )
UNIFR Rusconi 2006 Denkt jemanden wirklich daran Gendoping bald anzuwenden? bestimmt! Welche Sportart wird vermutlich 'das erste Fall' schaffen? Pferderennen? Welches Land wird die erste Gendoped Athleten 'anbieten'? ...China? Wird Gendoping effizienter als traditioneller Doping sein? Nein Ist es alles vielleicht nur einen Bluff (Abschreckungsmittel)? vielleicht auch... Wird es Opfern der Gendoping Nebeneffekte geben? Ja, bestimmt Welches Gen wird als erste gewaehlt für GD? Epo, dann IGF-1 Wird Gendoping schwierig zum entdecken bleiben ? Nein Ignoranz, Ehrgeiz, Gier Wieso bleibt GD so attraktiv? a a a a a a

35 Winterthurer Fortbildung - Dr. D. und A. Kappeler - Dr. P.E. Mullis
... Danke, und hoffen wir, dass der Sport uns noch über lange Zeit Emotionen mit viel Fairplay schenken wird UNIFR Rusconi 2006 Winterthurer Fortbildung - Dr. D. und A. Kappeler - Dr. P.E. Mullis meine Mitarbeiter an der UNIFR für evenktuelle Fragen: info zur SGT und download dieser Slides Show : a a a a a a

36 UNIFR Rusconi 2002 a a a a a a