Etablierung neue Gene ? 1. Block-PCR Gradienten-PCR

Präsentation zum Thema: "Etablierung neue Gene ? 1. Block-PCR Gradienten-PCR"—  Präsentation transkript:

1 Etablierung neue Gene ? 1. Block-PCR 14.03.09 Gradienten-PCR 15.03.09
Annealing: 54°C; MgCl2 4mM EJ28/5637 (1:2) Primer 0,5µM Gelbild CK wegschneiden Gradienten-PCR 55 5°C (50°C, 51,5°C, 53°C, 54°C, 55,5°C, 58°C, 60°C) UCA1: 3+4mM MgCl2: 5637 (1:3) (3 alte 5637) CK20: 4mM: 5637(1:2); EJ28+J82+RT4(1:2) nur 54°C;5mM: 5637 (1:2) Gelbild CK20 nur in RT4 Block-PCR (GA 20µl) 55°C, 3+4mM MgCl2 UCA1: 5637 (1:3); CK20: RT4(1:3) Gelbild CK wegschneiden Block-PCR (GA 50µl) (für Gelelution) 56°C, 3mM MgCl2 UCA1: 5637 (1:3); CK20: RT4(1:3) ? Gelbild

2 Gelelution, Ligation, Transformation, Ausplattieren
Klone picken CK20: 2; UCA1: 4 Plasmidpräp und DNA-Konz.-Bestimmung (Photometer) CK20: ng/µl  5µl UCA1: / 128ng/µl  7,9/ 5µl Kontrollverdau (NotI, PK DE-A) Gelbild Nicht geklappt, nur PK Agilent (DNA) ??? Block-PCR mit Klonen Programm wie GA 50µl Gelbild UCA1 gut, CK20 nicht ok, weil 5637 falsches template Agilent (DNA) ??? CK20=0 ; UCA1=4,8ng/µl Block-PCR mit neuen Klonen Für CK20, RT (1:2), Programm wie GA 50µl Gelbild ok

3 CK20 UCA1 Gelelution, Ligation, Transformation, Ausplattieren
10 Klone picken Plasmidpräp+Konz.-Bestimmung am Photometer 32,5-55ng/µl kein KV!!! Kontroll-Block-PCR mit 10 Klonen RT4 (1:2), Programm wie GA 50µl Gelbild PK+NK gleich?! Sequenzierung UCA1 2+4; CK20 1+9 UCA1 schlecht; CK20 ok CK20 UCA1 01 Test UCA1 Plasmid 1 und 4 01CK20 Test Plasmid 1 LC-PCR EJ28 (?:?), Kapillarcycler, Klon 1(nicht sequenziert, aber Block-Fragment ok), Klon 4 (sequenziert  Fragment nicht drin), Annealing ? LC-PCR mit 3 Kits RT4 (1:5), LC480, Klon 1 (Standardverdünnungsreihe 10e6-25), Annealing 56°C 10s (gleich ok gewesen  endgültiges Programm LC-Bild CP bei allen 3 Kits gleich (480 Probes Master etw.später als TaqManMAster); PM+TMM höhere Fluoreszenz als DNA-HP-Master LC-Bild Nur in EJ28  Ursache nicht diePrimer + Sonden, sondern Klonierung TMM

4 Matrix-Test für Beschichtung
Gelbild Keine Doppelbanden Oncoray TA-Vektor, 10 Klone Matrix-Test für Beschichtung (virale DNA) Gelbild Klonierungs-PCR Alle 10 Klone ok Gelbild Keine Doppelbanden bei bd. Matrices  Ausschluss falsche Rkt. 1-2 Standards, NK, PK Animpfen von 5 Klonen ( ) 02 CK20 Test Plasmid 1 LC-PCR mit versch. ZL,Urinen, TURBT-Gewebe (RT4, RT 112, J82, EJ28, 5637, HT1376, HT1197) Gelbild Kontrollverdau EcoRI, 8,5µl DNA H10 Gelbild ok Keine Doppelbanden Viele Probleme mit Elution! GFX!!! Sequenzierung Klon 1+10 ok LC-Bild CP: Urin 24-36; Gewebe 27-40; ZL spät CP 21 als Beginn (entspr.10e5); 10e3,10e3,500 GVO 450 08 Test UCA1 Plasmid 1 und 4 LC-PCR mit 3 Kits+ABI-Kits+ ? ABI: Universal PCR MM NoAmp Erase, TaqMan Gene Expression Kit; EJ28 (1:5), LC480, Klon 1 (GFX-Kit; c62,5ng/µl, Standardverdünnungsreihe 10e6-?), Annealing ? (gleich ok gewesen  endgültiges Programm Beschichtung Platten+LC GVO 449 LC-PCR PK+NK+Standards LC-Bild CP: ? TMM+480 Probes Master ok

5 } 1.Block-PCR Gradienten-PCR Block-PCR (GA 20µl) Block-PCR (GA 50µl)
... KV (CK20 5µl!) GELBILD (5 Klone) UCA1 als Bsp. Sequenzierung LC-PCR mit 3 Kits (bei UCA1 auch nur diese 3 anzeigen?!) + Gelbild CK20: LC-PCR mit versch. ZL GVO Beschichtung für CK20 (SP6T7)  Agilentbild (Erklärung!!!) Kontroll-PCR GELBILD