Vom Molekül zur Zelle Block 3 Seminar / Praktikum 1 Diese Präsentation befindet sich auf der Lehr-Inhalts Seite des Departments für Medizinische Biochemie unter der Adresse: www.meduniwien.ac.at/Medbch/Teaching Georg Weitzer, Ernst Müllner Max F. Perutz Laboratories (MFPL) Department für Medizinische Biochemie Medizinische Universität Wien, Jan 2007

Literatur Ergänzung der theoretischen Grundlagen und biochemisches Praktikum im Block 3 - vom Molekül zur Zelle Facultas Verlag Hans Goldenberg (Hg.) Zellbiologie, Wiley - Verlag Chemie Bruce Alberts ergänzend z.B. Chemie erleben (Abschnitt „Analytische Chemie“), Facultas - Universitäts Taschenbuch Verlag Edgar Wawra, Helmut Dolznig, Ernst Müllner Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Der praktische Teil der 1. Übung findet statt am: Institut für Medizinische Chemie Währingerstraße 10 Übungssaal III (Tiefparterre)

Trennmethoden Dünnschichtchromatographie Ionenaustauschchromatographie Reversed Phase Chomatography (apolare stationäre Phase, polares Elutionsmittel = mobile Phase) Gaschromatographie Gelfiltration (Größenausschluss Chromatographie) Elektrophorese Affinitätschromatographie Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Affinitätschromatographie: z.B. Reinigung eines Enzyms aus einer komplexen Mischung von Proteinen

Praktikumsbeispiel 1 Trennung von Aminosäuren mittels Dünnschichtchromatographie (nach ihrer Polarität) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Auftragen der Proben Zellulose auf Alufolie, polare, stationäre Phase Glasröhrchen Standard = Referenzwert Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Auftragen der Proben Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Dünschicht- Chromatographie- folie in Glastrog mit Laufmittel stellen Wanderungs- richtung der Proben Laufmittel, apolar, mobile Phase 35% Azeton / 35% n-Butanol in Acetatpuffer Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Dünnschichtchromatographie Trog Chemie erleben Wawra et al. gelber Farbstoff = Isatin

nach circa 2 Stunden: Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Markieren der Front Start Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Dünschichtchromatogramm nach der Färbung / Trocknung Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Wanderungs- strecke der mobilen Phase Wanderungsstrecke der Aminosäure Front Wanderungs- strecke der mobilen Phase Wanderungsstrecke der Aminosäure W(as) W(m) Start Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Auswertung W(as) = Rf(as) W(m) Rf = Retentionsfaktor Chemie erleben, Wawra et al. Nernstscher Verteilungssatz Verteilungskoeffizient c = [Aminosäure] mobile Phase [Aminosäure] stationäre Phase Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Verteilungskoeffizient c = Nernstscher Verteilungssatz Beschreibt die Verteilung eines Stoffes zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Phasen (z.B. gasförmig / flüssig oder flüssig / fest oder flüssig / flüssig). [Br2] Wasser Verteilungskoeffizient c = [Br2] Chloroform Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Praktikumsbeispiel 2 Gelfiltration Trennung der Moleküle nach ihrer Größe Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Gelfiltration Probe, z.B. Protein / Salz Gemisch Poren und Kapillaren kleine Moleküle können hinein, haben dadurch einen längeren Weg zurückzulegen als die großen, (die außen herum schwimmen) und kommen daher später aus der Säule heraus. Glasfritte große kleine Moleküle Fraktionen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Sephadex G25 Säulenmaterial in Elutionspuffer äquilibriert. 0.5 ml der Probe (Dextranblau und Methylrot) direkt auf die gerade trockengelaufene Glasfritte auftragen. Wenn vollkommen ins Säulenmaterial eingedrungen, mit ca. 5 ml Elutionspuffer nachspülen, 3 mal wiederholen. Austretender Elutionspuffer wird in Fraktionen zu je 20 Tropfen (= ca. 1 ml) gesammelt. Um Methylrot sichtbar zu machen, Fraktionen mit je 1 Tropfen HCl ansäuern. Dextranblau ist blau gefärbt. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Gelfiltrations - Chromatographie Säule Chemie erleben, Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Reagenzien für die Gelfiltration Elutionspuffer in Dispenserflasche Dextransblau / Methylrot Farbstoffmischung Salzsäure (HCl) zum Ansäuern und Entwickeln der Rotfärbung von Methylrot Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Gelfiltration Sammeln der Fraktionen Chemie erleben, Wawra et al.

Fraktionen nach der Gelfiltration Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Schema der Trennung eines Dextranblau / Methylrot Gemisches mittels Gelfiltration Farbintensität Fraktionen Dextranblau: großes Molekül, eluiert zuerst Methylrot: kleines Molekül, kommt später aus der Säule heraus Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Praktikumsbeispiel 3 Elektrophorese Trennung von geladenen Molekülen im elektrischen Feld Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Trennung und quantitative Analyse der Serumproteine Voraussetzungen: Serumproteine müssen positiv oder negativ geladen sein. richtige Wahl des Puffers ! Trägermaterial (analog zur stationären Phase) Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Arbeitsplatz Elektrophorese Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Elektrophorese Apparatur Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

pipettieren kleiner Volumina mit automatische Pipetten Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Elektrophorese - Probenvorbereitung Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Proben aufgetragen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

+ Tröge mit Pufferlösung Cellogel, Trägermaterial Anode Kathode Platin Elektroden Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Welchen pH-Wert muss die Pufferlösung haben, wenn alle Proteine zur Anode wandern sollen? Der isoelektrische Punkt pI der Serumproteine ist ~ 5. Daher muss der pH des Puffer > 5 sein (in der Praxis bei etwa pH = 9), damit ALLE Proteine negativ geladen werden ... Chemie erleben, Wawra et al. ... ansonsten würden der Anteil an positiv geladenen Proteinen zur Kathode wandern Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

+ Anode Proben Kathode 250V 30 min Standard Serum Gleichstromquelle negativ geladene Proteine (Anionen) wandern zur positiv geladenen Anode Wanderungsrichtung Anode Proben Kathode 250V 30 min Standard Serum Gleichstromquelle Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3- ? Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Zwischenfrage: Warum gibt es im Blut mehr Kationen, wie Na+, K+, Ca++, Mg++ als Anionen, wie Cl-, HCO3- ? Weil die Anionenlücke durch die negative Ladung der Proteine bei pH 7.4 ausgeglichen wird. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Gleichstromquelle: 250 V Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Nach der Elektrophorese Färben der Proteine Trägermaterial durchsichtig machen Photometrische (densitometrische) Auswertung Messen der Farbstoffdichte entlang des Trägermaterials Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

aufgetrennte Serumproteine Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Probe wird am Detektor vorbeigezogen Das Prinzip der Auswertung ... Fläche ist proportional der Farbmenge, also auch der Proteinmenge Detektor Lichtquelle Probe wird am Detektor vorbeigezogen Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

E = e x c x d ... beruht auf dem Lambert-Beerschen Gesetz E = log (1/T) = log (I0/I) E = Extinktion e = spez. Molarer Extinktionskeoff. c = Konzentration d = Schichtdicke I0 I Photozelle Lichtquelle Prisma Küvette d = 1 cm Detektor Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

verwendetes Densitometer (ein Typ von Photometer) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Ausdruck der Ergebnisse Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Elektrophorese von Serumproteinen Chemie erleben Wawra et al. Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

diagnostische Aussage- möglichkeiten (Beispiele) für eine ausführlichere Darstellung siehe z.B. www.med4you.at/ laborbefunde/ lbef_ephorese_ eiweiss.htm aus: “Ergänzung der theoretischen Grundlagen”, H. Goldenberg, (Hg.) Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Protokoll zur Bewertung der Ergebnisse Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007

Fotos: Gelfiltration-Auswertung neu fertige Aminosäure-Dünnschicht neue Ausdrucke Densitometer Foto Lageplan Foto Med. Chem. Gebäude (von Homepage) Informationen zur Protein-Elpho: www.med4you.at/laborbefunde/lbef_ephorese_eiweiss.htm Georg Weitzer, Ernst Müllner, MFPL 01/2007