Hauptseminar Biophysik der Systeme Crime Scene ? DNA Hauptseminar Biophysik der Systeme

Konvektive Polymerase Kettenreaktion Martina Bucher Sebastian Karpf 14.11.2007 Hauptseminar Biophysik der Systeme

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Englisch: Polymerase Chain Reaction Millionenfache Vervielfältigung von DNA Erzwungene, kontrollierte Replikation DNA-Polymerase „produziert“ Kopien In vitro PCR Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme Gliederung Grundbausteine der PCR Theoretische Grundlagen Schritte des PCR-Prozesses Was ist Konvektion? Bedingungen für Konvektion Aufbauten Anwendungsgebiete Zusammenfassung Hauptseminar Biophysik der Systeme

Grundbausteine der PCR DNA Primer DNA-Polymerase Pufferlösung dNTP-Mix Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

DNA – Träger der Erbinformation Doppelhelix 4 heterozyklische Nukleobasen Purine: Adenin und Guanin Pyrimidine: Thymin und Cytosin Desoxyribose Phosphatreste Wasserstoffbrückenbindungen Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme Primer Einsträngig Keine Wiederholung von Motiven Länge: 20-30 Nukleotide GC-Gehalt: 40-60% cfrei/cgebunden = e(-G(T)/kT) G(T) = H-TS Schmelztemperatur Tm: G(T) = 0 Tm = 2°C•(A+T)+4°C•(C+G) (Näherung) Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum, Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme DNA-Polymerase Allgemein: Enzyme für Polymerisation von Nukleotiden Mit und ohne Korrektur-Funktion Für PCR meistens Tag-Polymerase (Bakterium Thermus aquaticus) Außerordentlich hitzebeständig Hauptseminar Biophysik der Systeme

Pufferlösung und dNTP-Mix Volumenregulation Chemische Umgebung: PH-Wert Ionenkonzentration: Mg2+-Ionen für DNA-Polymerase dNTP-Mix: Bausteine für DNA-Strang Hauptseminar Biophysik der Systeme

Theoretische Grundlagen cTemplate << cPrimer Anstieg der Zahl der Kopien exponentiell Zahl der Duplikate dominant Zahl der Kopien nach n PCR-Zyklen: N = (2n-2n) • N0 mit 2n: Zahl der Produkte des 1. und 2. Zyklusses Quelle: F-Praktikum Hauptseminar Biophysik der Systeme

Schritte des PCR-Prozesses Denaturierung Primerhybridisierung Elongation Ende des 1.Zyklus Hauptseminar Biophysik der Systeme

Schritte des PCR-Prozesses Denaturierung (94-96°C): Schmelzen der DNA Primerhybridisierung (Tm-5°C): Andocken der Primer an das komplementäre DNA-Stück Elongation (72°C): Verlängerung Ende des 1.Zyklus Quelle: Wikipedia.de, F-Praktikum Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme 2. Teil: Konvektive PCR Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme Was ist Konvektion? Konvektion (lat. Convehere = mittragen) = Fließen von Teilchen bzw. Flüssigkeiten aufgrund von Temperaturgradienten Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme PCR durch Konvektion Für die Polymerase Kettenreaktion werden zyklisch-periodische Temperaturstufen benötigt  Konvektion schafft diese Zyklen! Hauptseminar Biophysik der Systeme

Konvektive PCR versus Herkömmliche PCR Vorteile: Schnelle Amplifikation Nur 2 Temperaturen nötig Nicht so träge, da keine großen Heizelemente benötigt werden Hauptseminar Biophysik der Systeme

Konvektionsbedingungen I Wichtige Eckpunkte für Konvektion: Fließgeschwindigkeit v Fließlänge L Viskosität  Reynolds Nummer Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

Konvektionsbedingungen II Für Konvektion muss die Reynoldszahl unter 1000 liegen Dies bedeutet: Kleines v, Kleines L Großes  Zur Erinnerung: Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

Konvektionsbedingungen III Größe der Reaktionskammern müssen zwischen 100 m und einigen cm liegen Darunter: Diffusionsprobleme Darüber: nicht-laminarer Fluß D.h. Konvektion kann über bis zu 6 Größenordnungen durchgeführt werden (L3  106) Bei gutem Verlauf Verdoppelung der DNA nach jedem Zyklus (=Zyklusperiode) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme Aufbauten Drei Beispiele für Konvektionskammern: Kreisrohr (circular pipe) Rayleigh-Bénard-Zelle Zylinderzelle (cylindrical chamber) zu c) zu a) zu b) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

a) Kreisrohr (circular pipe) Vorteile: gesamtes Volumen zirkuliert niedriger Energieverbrauch (Batteriebetrieb möglich) Nachteile: Parabolisches Fließprofil  stark unterschiedliche Perioden der Amplifikationszyklen Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

b) Rayleigh-Bénard-Zelle Konvektionskammer zwischen 2 geheizten Platten. Es bilden sich Konvektions-Zirkulationen. Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

b) Rayleigh-Bénard-Zelle ΔT < ΔTkrit,1 : Viskosität überwiegt Konvektionsströmung ΔTkrit,1 < ΔT < ΔTkrit,2 : Es treten regelmäßig geformten Konvektionszellen auf, die Bénard-Zellen ΔTkrit,2< ΔT : Das System gelangt ins Chaos Quelle: Wikipedia.de Hauptseminar Biophysik der Systeme

b) Rayleigh-Bénard-Zelle Vorteile: einfacher-kompakter Aufbau Nachteile: Viel Energie für Heizplatten benötigt Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme c) Zylinderzelle Erklärung anhand der Versuchsaufbauten gefunden in: (1) „Exponential DNA Replication by Laminar Convection“ Von Dieter Braun et al., 2003 (2) „PCR by Thermal Convection“ von Dieter Braun Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Arbeit von Dieter Braun Infrarotlicht (1480 nm) im Zentrum des 1mm x 5mm großen Zylinders Umgebungstemperatur 52°C Errechnete Reynoldsnummer für: laminaren Fluss Länge L  2mm Viskosität von Wasser   1mm2/s typische Geschw. v  0,4mm/s ergibt Re  1 Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme Ergebnisse Bereits nach 25 Minuten ergab sich 100.000-fache Amplifikation DNA ließ sich durch Fluoreszenzmarker visualisieren Gewünschte DNA-Amplifikation über Gelelektrophorese überprüft und bestätigt Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Visualisierung der DNA Interkalierende Fluoreszenzmarker binden nur an doppelsträngige DNA Man erkennt die Amplifikation der DNA Dunkle Stellen deuten auf Einzelstränge hin Nach Auschalten des IR-Lichtes verschwand der schwarze Punkt im Zentrum Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Visualisierung der DNA Quelle: Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

Analyse durch Gelelektrophorese Vergleich mit DNA bekannter Länge bestätigt, dass 100bp DNA-Sequenzen amplifiziert wurden. Die Probe nach 0 min zeigt keine 100bp Sequenzen. Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Temperaturabhängigkeit der PCR wurde durch kontinuierliche Leistungsänderungen der Infrarotquelle bestimmt. (bei bestimmter Bahn z0=50m) Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Video der zylindrischen konvektiven PCR Quelle: Dieter Braun Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme c) Zylinderzelle Vorteile: Sehr schnell (25 min für 100.000-fache Amplifikation) Hohe Effizienz (50%), da gutes Strömungsverhalten Geringe Energie benötigt (Batteriebetrieb möglich) Nur optisch, keine Heizkontakte nötig Quelle: (1), (2) Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme Anwendungsgebiete Genetischer Fingerabdruck Vaterschaftstest Erkennung von Krankheiten Klonierung von Genen Mutagenese Analyse alter (fossiler) DANN Geschlechtsbestimmung Pränataldiagnostik Hauptseminar Biophysik der Systeme

Hauptseminar Biophysik der Systeme Zusammenfassung PCR vermehrt exponentiell eine gewünschte DNA-Sequenz, wobei nur kurze Sequenzen amplifiziert werden können Konvektive PCR ist high-speed PCR Einfache Designs Kostengünstige Möglichkeit Sehr kleine Versuchsaufbauten möglich Hauptseminar Biophysik der Systeme