Seminar von Sandra Selzer Betreuer: Hr. Prof. Dr. Kohring Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents I.M. Banat et al., Applied Microbiology and Biotechnology, 2014 Seminar von Sandra Selzer Betreuer: Hr. Prof. Dr. Kohring

Agenda 1. Biofilme: Definition und Entstehung 2. Biotenside 3. Oberflächen für Biofilmbildung 4. Quantifizierung des Wachstums/Inhibierung von Biofilmen 5. Inhibierung von Biofilmen 5.1. Lipopeptide 5.2. Glykopeptide 6. Zusammenfassung Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

1 2 3 4 5 6 1. Biofilm - Definition „...Akkumulation einzelner Bakterienzellen und Mikrokolonien an der Grenzfläche zwischen zwei verschiedenen Phasen. Ein Biofilm ist wie eine kleine Stadt, in der die Zellen, die nur 1 oder 2 µm lang sind, Hochhäuser bauen die hunderte µm hoch sein können. Die „Straßen“ zwischen den Hochhäusern sind flüssigkeitsgefüllte Kanäle, die Nährstoffe, Sauerstoff und andere Bestandteile zu den Biofilmgemeinschaften bringen.“ Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents Quellen: [1]http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/10032002/00004/PHIL_2264_lores.jpg [2] http://www.medicinenet.com/script/main/art.asp?articlekey=16932, 2012

1 2 3 4 5 6 1. Biofilme besiedeln Mikroorganismen feste Oberflächen wird von Biofilmen gesprochen entstehen an Grenzschichten dienen Mikroorganismen zum Schutz vor Umweltbedingungen quorum-sensing ermöglicht Verhalten als Population bestehen meist aus einer komplexen Mischung an Mikroorganismen sind beteiligt an z.B.: Infektionen, Verbreitung von Krankheiten, hygenischen Verarbeitung, Nahrungsmittelbefall, metallverarbeitende Industrie ----- Besprechungsnotizen (15.07.15 09:36) ----- Physiologie unterschiedlich im Vgl. planktonischen Bakterien können multizellulär differenzieren können resistenter sein als einzelne phänotypische Veränderung Chemotherapie --> erhöhte Resistenz Bsp: Plaque Nachteile: Biofouling, Hygiene, Reistenz Vorteile: Abfallbehandlung, Bodensanierung, Bioreaktoren Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

1 2 3 4 5 6 1. Biofilmbildung ----- Besprechungsnotizen (15.07.15 09:36) ----- 1. hefeten sich an (pili, van der Waals) 2. Monolayer, Mikrokolonien durch Adhäsine Schleim EPS extrazelluläre polmere Substanz kann Poren enthalten, Hauptbestandteil Biomassen, Dient Schutz vor Austrocknung, Stofftransport 3. einzelne Zellen freigesetzt, neu ansiedeln Gründe: O2 Mangel, Erhöhung Strömungswiderstand mit zunehmender Dicke Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents Quellen: [1] http://www.biofilm.montana.edu/files/CBE/images/r2003_PSTO_BFIN3STEPS.feature%20blurb.jpg

2. Biotenside 1 2 3 4 5 6 Tenside mikrobieller Herkunft amphiphiler Charakter ermöglicht das Herabsetzen der Oberflächenspannung vielversprechende Kandidaten bei Inhibierung von Biofilmen Einsatz auch in industrieller Biotechnologie Vorteile gegenüber synthetischen Tensiden: Spezifität geringe Toxizität biologisch abbaubar nachhaltig robust gegen pH und Temperatur ----- Besprechungsnotizen (15.07.15 09:36) ----- nicht konkurrenzfähig hohe Produktionskosten Einsatz: Umweltsanierung, Haushalts-und Reinigungsprodukte Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents Quelle: [1] http://www.allianz-reinigungstechnik.de/de/projekte/biotenside/_jcr_content/stage/image.img.jpg/ Banner_Biotenside.1383324053462.jpg

2. Biotenside: Funktion zellulärer Metabolismus Bewegung Abwehr 1 2 3 4 5 6 2. Biotenside: Funktion zellulärer Metabolismus Bewegung Abwehr als quorum-sensing Moleküle Schmiermittel Aufnahmesteigerung von schlecht löslichen Substraten Immunmodulation Virulenzfaktoren Sekundärmetabolite antimikrobielle Faktoren ----- Besprechungsnotizen (15.07.15 09:36) ----- Messen: reduzierte Oberflächenspannung Kritische Mizellkonzentration oberhalb derer Mizellbildung auftritt Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

3. Oberflächen physikochemischen Eigenschaften beeinflussen die: 1 2 3 4 5 6 3. Oberflächen physikochemischen Eigenschaften beeinflussen die: Biofilmadhäsion Biofilmarchitektur im Fall von Monokulturen Selektion der koloniebildenden Spezies im Fall von Mischkulturen und Proteinexpression kann substratabhängig variieren Beispiele: Glas, Plastik, Metall, Silikone, Gewebemodelle ----- Besprechungsnotizen (15.07.15 09:36) ----- raus, Hydrophob, hydrophil, usw. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

4. Quantifizierung Biofilmbildung in 8-well Kammer 1 2 3 4 5 6 4. Quantifizierung Biofilmbildung in 8-well Kammer Kristallviolett- Färbung Fluoreszenzfärbung Rasterelektronenmikroskop Calgary biofilm device Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

4. Calgary Biofilm device 1 2 3 4 5 6 4. Calgary Biofilm device Planktonische Zellen gemessen nicht Biofilm, aber es gibt Bakterien die im Biofilm noch leben aber nicht mehr kultivierbar sind Deckel mit Einsätzen 96 Mikrotiterplatte für Kultivierung Biofilmbildung Oberfläche der Einsätze: ~ 44 mm² Animpfdichte: Bis 1 x 10⁶ Zellen/well Inkubationszeit: 4 – 24h Kultivierungsgeschwindigkeit: ≥ 10 rpm Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

1 2 3 4 5 6 5. Inhibierung von Biofilmen - Warum existieren Biofilme noch, wenn Biotenside diese effektiv bekämpfen?- Hypothese: oberflächenaktive Moleküle spielen eine große Rolle in der Entwicklung und Aufrechterhaltung von Biofilmen bedingt durch die Aufrechterhaltung von Wasserkanälen führen zu Nährstoffversorgung, Gasaustausch und Abgrenzung von Teilen des Biofilms (Plankton) Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

5.1. Inhibierung von Biofilmen - Lipopeptide - 2 3 4 5 6 5.1. Inhibierung von Biofilmen - Lipopeptide - größte Gruppe an Biotensiden zur Bekämpfung von Biofilmen bestehen aus 3 oder mehr Variationen an homologen oder kongeneren Molekülen aufgebaut aus hydrophilen Peptid, welches an eine hydrophobe Fettsäure oder Lipid angeheftet ist Peptide können aliphatisch, verzweigt oder zyklisch sein Lipidketten können in ihrer Länge variieren meisten Lipopeptide stammen von Bacillus oder Paenibacillus Kongenere (auch Congenere) sind chemische Verbindungen, die durch ihren Ursprung oder ihre Struktur in Beziehung stehen. Häufig weisen sie den gleichen Stamm, d. h. die gleiche Grundstruktur auf. Die Summenformeln zweier Verbindungen, die Kongenere sind, können sich unterscheiden; es handelt sich nicht zwangsläufig um Isomere. Kongenere Verbindungen können unterschiedliche chemische, physikalische und toxikologische Eigenschaften haben. Sie treten häufig als Gemisch auf. Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

Auswirkungen Lipopeptide Biotensid Wirkt gegen Inhibierung/ Reduktion Polymyxin P. aeruginosa um 99% reduziert in 12h Polymyxin, Surfactin & Fusaricidin S. aureus, Streptocuccus bovis, Bacillus subtilis, P. aeruginosa, Biofilmbildung marine Biofilme um 72,4% reduziert Fengycin S. aureus 90% Dispersion E.coli 97% Dispersion Putisolvin Pseudomonas Dispersion, aber hilft P. putida bei Biofilmbildung Pseudofactin Enterococcus faecalis, E.coli, S. epidermidis, E. hirae, Proteus mirabilis 36-90% effektiv gegen Adhäsion 26-70% gegen existierende Biofilme C. albicans 8-9% Inhibierung des Wachstums 99% Prävention der Adhäsion Surfactin Salmonella sp. Keine Angabe marine: etablierte Biofilme Pseudofactin: adhäsion auf Glas, Polystyrene und Silikon Surfactin: formen Kanäle  erhöhte Durchlässigkeit Biofilm Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

Kombination von Lipopeptiden Kombination von Lipopeptiden bei komplexen Biofilmen führen zu: 99% Inhibierung Biofilmbildung 74% Inhibierung etablierter Biofilme Synergien zwischen Lipopeptiden und Antibiotika teilweise totale Beseitigung von Biofilmen Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

Bekämpfung von Biofilmen - Polymyxin - 1 2 3 4 5 6 Bekämpfung von Biofilmen - Polymyxin - aufgebaut aus zyklischem Polypeptid mit Fettsäure begrenztes Wirkspektrum gegen gram-negative Bakterien Wirkmechanismen noch weitgehend unbekannt ----- Besprechungsnotizen (15.07.15 09:36) ----- kommerziell erhältliche Formulierungen wie Neosporin, Colistin Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

5.1. Inhibierung von Biofilmen - Surfactin - 2 3 4 5 6 5.1. Inhibierung von Biofilmen - Surfactin - urspünglich aus B. subtilis isoliert zyklisches Peptidheptamer verbunden mit einer β-hydroxy Fettsäure effektiv aber auch zytotoxisch mit hämolytischer Aktivität Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

5.2. Inhibierung von Biofilmen - Glykolipide - 1 2 3 4 5 6 5.2. Inhibierung von Biofilmen - Glykolipide - Mono-oder Oligosaccharide glykosidisch mit Lipidmolekülen verknüpft sind an der Außenseite der Lipid-Doppelschicht zu finden Biotensid Wirkt gegen Inhibierung/ Reduktion Rhamnolipide Streptococcus salivarius, Candida tropicalis 66% Adhäsion Yarrowia lipolytica 67% Dispersion  effektiver als SDS Sophorolipide E. coli, B. subtilis existierende Biofilme Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

5.2. Inhibierung von Biofilmen - Rhamnolipide - 1 2 3 4 5 6 5.2. Inhibierung von Biofilmen - Rhamnolipide - Di-oder Monorhamnosezucker an einer Fettsäure inhibieren bakterielles Wachstum durch Ablösung der Zellen urspünglich aus P. aeruginosa isoliert auf Silikon konnte Zelladhäsionvon Streptocuccus salivarius um 66% reduziert werden ----- Besprechungsnotizen (15.07.15 09:36) ----- Ersatz für chemische Tenside in Öl-und Petroleum Industrie für Biosanierung von ölkontaminierten Umgebungen Biofilmformation von Pseudomonas Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

5.2. Inhibierung von Biofilmen - Rhamnolipide - 1 2 3 4 5 6 5.2. Inhibierung von Biofilmen - Rhamnolipide - Biofilmbildung von P. aeruginosa auf Deckglas Effekt auf Biofilme von P. aeruginosa PAO1 auf einem Deckglas a) nach 48h Wachstum b) nach 30-minütiger Behandlung mit Rhamnolipiden (5%) Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

5.2. Inhibierung von Biofilmen - Sophorolipide - 1 2 3 4 5 6 5.2. Inhibierung von Biofilmen - Sophorolipide - Dimer aus Sophorosezucker und einer langkettigen Fettsäure in Hefen dienen sie voraussichtlich als Kohlenstoffspeicher und als Abwehr gegen andere Mikroorganismen ----- Besprechungsnotizen (15.07.15 09:36) ----- produziert von Hefe, Gattung candida Synergien zwischen S. und Antibiotika um Biofilme zu zerstören Live Dead Baclight Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents Quelle: [1] http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/rhamno/Figure05.png

1 2 3 4 5 6 6. Zusammenfassung Biofilme sind an der Verbreitung von luftübertragenen Pathogenen, Verschmutzung von industriellen Oberflächen und vielen Infektionen beteiligt Probleme verschärfen sich durch resistente Biofilmpopulationen und Mangel an Alternativen Biotenside stellen eine Alternativtherapie dar Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

Quellen [1] I. M. Banat: Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents; Appl. Microbiol Biotechnol (2014) [2] http://phil.cdc.gov/PHIL_Images/10032002/00004/PHIL_2264_lores.jpg [3] http://www.medicinenet.com/script/main/art.asp?articlekey=16932, 2012 [4] http://www.biofilm.montana.edu/files/CBE/images/r2003_PSTO_BFIN3STEPS.feature%20blurb.jpg [5] http://www.allianz-reinigungstechnik.de/de/projekte/biotenside/_jcr_content/stage/image.img.jpg/ Banner_Biotenside.1383324053462.jpg [6] http://lipidlibrary.aocs.org/Lipids/rhamno/Figure05.png [7] http://www.nature.com/nprot/journal/v5/n7/fig_tab/nprot.2010.71_F1.html Microbial biofilms: biosurfactants as antibiofilm agents

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