Respiration Activity Monitoring System Bioprozessoptimierung Viele Versuche, die bisher nur aufwändig in einem Fermenter mit Abgasanalytik durchgeführt werden konnten, können nun viel kostengünstiger und parallel in einem Bruchteil der Zeit mit RAMOS erledigt werden. Es ist allgemein bekannt, dass die um einen Tag frühere Einführung eines neuen Produktes am biopharmazeutischen Markt, eine Millionen Dollar wert sein kann. Daran gemessen könnte sich ein RAMOS System innerhalb von Stunden amortisieren! Selbst bei konservativer Betrachtung amortisiert sich RAMOS durch Einsparung von Laborstunden und die Verkürzung von Entwicklungszeiten im Handumdrehen. Darüber hinaus können die Produktionskosten nachhaltig und entscheidend reduziert werden durch effizientere Stämme, die mit Hilfe von RAMOS gefunden werden können. Respiration Activity Monitoring System © HiTec Zang GmbH - HRE
Online – Bestimmung der Atmungsaktivitäten Bioprozessoptimierung Online – Bestimmung der Atmungsaktivitäten (OTR, CTR, RQ) in Schüttelkolben In der folgenden Präsentation werde ich Ihnen ein Gerät vorstellen, welches steril die Atmungsaktivität von Bakterien, Hefen, Pflanzen-, Insekten- und Säugerzellkulturen in Schüttelkolben misst. Der Name des Gerätes ist RAMOS, was für Respiration Activity MOnitoring System steht Respiration Activity Monitoring System © HiTec Zang GmbH - HRE
Das Tablar Auf dem Tablar, welches komplett entnommen werden kann, befinden sich 8 instrumentierte Schüttelkolben. Bis zu 6 normale Schüttelkolben (Schlachtkolben) können zusätzlich angebracht werden. © HiTec Zang GmbH - HRE
Anwendungsgebiete Online-Verfolgung der Stoffwechselaktivität von pro- und eukaryotischen Kulturen in Schüttelreaktoren Ein Beispieldiagramm, OTR, CT und RQ. © HiTec Zang GmbH - HRE
Anwendungsgebiete Einfache Ermittlung von Kenngrößen: Sauerstofftransferrate (OTR) Kohlendioxidtransferrate (CTR) Respirationsquotient (RQ) maximale Wachstumsrate (µmax) volumetrischer Sauerstoffübergangskoeffizient (kLa) …, die ein sicheres Scale–Up ermöglichen. Typische Messparameter von RAMOS sind (…) © HiTec Zang GmbH - HRE
Anwendungsgebiete Schnelle Erkennung von charakteristischen biologischen Phänomenen. OTR Verläufe: Unlimitiertes Wachstum auf Minimalmedium Substratlimitierung (außer C-Quelle) Sauerstofflimitierung maximale Sauerstoff-transferkapazität Sauerstofftransferrate Sauerstofftransferrate Sauerstofftransferrate Fermentationszeit Fermentationszeit Fermentationszeit Produktinhibierung ( z.B. pH, Temp.) Effekte einiger biologischer Phänomene. Die X-Achse der Graphen stellt die Fermentationszeit und die Y-Achse die Sauerstofftransferrate (OTR) dar. Das erste Bild zeigt unlimitiertes Wachstum von Mikroorganismen. Der OTR steigt exponentiell mit der Anzahl der Mikroorganismen. Dann ist das essentielle Substrat, meistens die C-Quelle, veratmet. Die Mikroorganismen stoppen ihre Atmung und der OTR fällt rapide ab. Dieser Abfall ist fast immer ein Anzeichen dafür, dass die C-Quelle verbraucht wurde. Wenn ein anderes Substrat, wie Stickstoff oder Phosphat, limitierend wird, dann stoppen die Mikroorganismen ihr Wachstum und das führt zu einem langsamen Abfall des OTR (Abbildung 2). Wenn Sauerstoff limitierend wird, sieht der OTR wie in Abbildung 3 aus. Die Kurve erreicht ihre maximal mögliche Sauerstofftransferkapazität und endet in einem Plateau. In Abbildung 4 kann eine Produktinhibierung detektiert werden. Der langsamere Anstieg des OTR als direkter Einfluss des toxischen Stoffes und das rapide Abfallen, sobald das Toxin eine zu hohe Konzentration erreicht hat. Das nächste biologische Phänomen ist das diauxische Wachstum. Das bedeutet, dass die Kultur zwei unterschiedliche C-Quellen veratmen kann. Die erste C-Quelle führt zu einem Anstieg des OTR bis zu ihrer Veratmung. Nach einem kurzen Abfall des OTR steigt dieser wieder an, da die Mikroorganismen nun eine zweite C-Quelle erschlossen haben. Die letzte Information, die anhand des OTR gewonnen werden kann, ist der totale Sauerstoffverbrauch der Mikroorganismen über die gesamte Fermentationszeit. Dafür wird der OTR vom Anfang der Fermentation bis zum Ende integriert. Mit dieser Information lässt sich ein Bioprozess bilanzieren. Diese Beispiele sind natürlich Theorie, in der Praxis haben Sie meistens eine Mischung aus diesen Basistypen. Diauxie = gesamter Sauerstoffverbrauch [mol/l] Sauerstofftransferrate Sauerstofftransferrate © HiTec Zang GmbH - HRE Fermentationszeit Fermentationszeit
Anwendungsgebiete Schnelle Erkennung von charakteristischen biologischen Phänomenen. CTR-Verläufe: Effekte der CO2-Transferrate (CTR) und des Respiaraionskoeffizenten (RQ). © HiTec Zang GmbH - HRE
Anwendungsgebiete Ermittlung geeigneter Bedingungen für das konventionelle Massenscreening (Versuchsdauer, Medien, Betriebsbedingungen …) Optimieren von Substratkonzentrationen und Reduzierung der Entwicklungszeiten für Medien Bilanzieren von Fermentationen (Toxizitäts- und Proliferationsassays) Die Hauptanwendungsgebiete sind (...) Wachstumskontrolle unter sterilen Bedingungen Gezielte Probennahme nach der Sauerstofftransferrate © HiTec Zang GmbH - HRE Qualitätskontrolle
? OTR CTR RQ Stand der Technik gerührter Bioreaktor geschüttelter Online- Abgasanalytik OTR CTR RQ online ? Die Online-Messung des OTR, CTR und des RQ ist bei gerührten Fermentern mit Abgasanalytik Stand der Technik. Bezüglich der Atmungsaktivitätsmessung, der Schüttelkolben ist immernoch eine “Black box” oder bessser, eine “Black Flask” gerührter Bioreaktor geschüttelter Bioreaktor © HiTec Zang GmbH - HRE
Motivation „Die Nachteile des Schüttelkolbens als Experimentiersystem, sind die, dass der Experimentator nur sehr begrenzte Möglichkeiten der Überwachung und Regelung hat.“ Payne et al., 1990 ... „Die Schwäche von small-scale Flüssigfermentationen: diskontinuierliche Überwachung“ Hilton, 1999 © HiTec Zang GmbH - HRE
Spurenelemente, Vitamine Was wird gemessen? Spurenelemente, Vitamine Kohlenstoffquelle (Glutamin, Glucose, ...) Stickstoffquelle (Ammonium, Harnstoff, Hefeextrakt, Pepton, ...) Phosphorquelle (Phosphat, Phytin) Sauerstoff Kohlendioxid Schwefelquelle (Sulfat, Cystein, ...) Es gibt viele Möglichkeiten an Komponenten, die als Online-Signal gemessen werden können, wie z.B. (…) Als C-Quelle kann man z.B. Glucose oder Glutamine messen, oder als Produkt Alkohol oder Proteine (Antikörper) Es ist aber bekannt, dass die universellste Messgröße als Signal für alle aeroben Mikroorganismen die Sauerstofftransferrate (OTR) und die Kohlendioxidtransferrate (CTR) sind. Produkt (Alkohol, Proteine, Aminosäuren, ...) © HiTec Zang GmbH - HRE
? Unbekannter Fermentationsverlauf Normaler Schüttelkolben: A B Kulturverlauf A ? B Wir können in einem Schüttelkolben keine Aussage über den Verlauf der Fementation machen. Um zu zeigen, wie wichtig diese Information in der Prozessentwicklung ist, hier eine Beispielfermentation. Mit dieser Fermentation werden zwei Stämme, A und B, miteinander im Wachstumsverhalten verglichen, um den höchsten Produkttiter zu erhalten. Um den besseren Stamm zu finden, nimmt der Experimentator zu einem Zeitpunkt eine Probe. Die Analyse der Probe ergibt, dass Stamm A eine höhere Produktkonzentration aufweist. Folglich muss Stamm A besser sein, als Stamm B. Zeit Versuchsende © HiTec Zang GmbH - HRE
Fermentationsverlauf Bekannter Fermentationsverlauf Kulturverlauf A B B A Wenn man aber ein Online-Signal hat, erhält man folgenden Kurvenverlauf. Nun ist der Favourit nicht mehr Stamm A, sondern Stamm B, und das zu einem früheren Zeitpunkt. Dieses Beispiel ist ein bisschen übertrieben, aber wir kennen alle die Fälle, wo eine nicht optimale Fermentation wertvolles Substrat verschwendet und teuere Fermentationszeit kostet. Mit diesem Beispiel möchte ich den Vorteil eines Online-Signals während eines gesamten Bioprozesses hervorheben. Diese Information ist besonders wichtig am Anfang der Bioprozessentwicklung, z.B. in der Screening-Phase. Zeit Versuchsende © HiTec Zang GmbH - HRE
Lösung bestimmt online die Atmungsaktivitäten (OTR, CTR, RQ) von aeroben Mikroorganismen in Schüttelkolben unter sterilen Bedingungen Um das Problem zu lösen, entwickelten wir das RAMOS, das die Atmungsaktivität in Schüttelkolben unter sterilen Bedingungen online messen kann. © HiTec Zang GmbH - HRE
Klare Vorteile Mehr Informationen über die mikrobiologischen Prozesse im Schüttelkolben Schnelle Charakterisierung und gezielte Optimierung von Medien Ersetzt teure Versuche im Fermenter Paralleltechnik (Zeit, Vergleichbarkeit, …) Einfache Handhabung Schafft optimale Screeningbedingungen Ihre Vorteile sind (…) Erkennung des optimalen Inokulierungszeitpunktes Quasi-Non-Stop-Betrieb durch sehr kurze Rüstzeiten Reduzierung der Versuchsdauer auf die tatsächlich erforderliche Zeit © HiTec Zang GmbH - HRE Unterscheidung betriebsbedingter und biologischer Effekte
Messkolben Unser Ziel war es, identische Fermentationsbedingungen in der Messflasche, wie im konventionellen Schüttelkolben zu schaffen. Um dieses Ziel zu erfüllen, musste eine identische Hydrodynamik in der Flüssigkeit und eine identische Gasdynamik im Kopraum des Kolbens erreicht werden. Auf diesem Bild ist zu erkennen, dass der normale Schüttelkolben einen Wattestopfen als Sterilbarriere besitzt. Daneben sehen sie den neudesignten Messkolben. Die Modifikationen betreffen nur den oberen Teil des Schüttelkolbens. Das wichtige hierbei ist, dass wir keinerlei Veränderungen im Flüssigkeitsbereich, wo die Flüssigkeit rotiert gemacht haben. So stören wir nicht die Hydrodynamik. Wir installierten ausserdem keinen inversen Sensor. Unser Sensor ist im Deckel angebracht und misst den Sauerstoffpartialdruck in der Gasphase. Zwischen Sensor und Kolbeninneren sitzt eine Sterilbarriere, so das der Kolben steril entnommen werden kann, während der Sensor im Inkubator verbleibt. © HiTec Zang GmbH - HRE
Beispielfermentationen Ermittlung der optimalen Inokulierungs– und Fed-Batch– Startzeit Tierische Zellkultur Hybridoma (50 mL Kulturvolumen) OTR CTR Zelldichte OTR/CTR [mol/(L·h)] Zelldichte [N/mL] Das Diagramm zeigt die Säugerzellkultur Hybridoma über 200 h Fermentation. Die Zelldichte steigt exakt so an, wie der OTR in der exponentiellen Wachstumsphase. Das bedeutet, dass der OTR proportional zu der Wachstumsrate ist. Der CTR läuft oberhalb des OTR, was auf einen Effekt des Glutamins im Medium zurückzuführen ist. Während es disoziiert bewirkt es eine Freisetzung von CO2 an die Gasphase. Nach ca. 90 h fallen der OTR und der CTR innerhalb von 15 h steil ab. Das bedeutet, dass das limitierende Substrat, hier Glutamin, vollständig aufgebraucht wurde. In diesen 15 h regulieren die Zellen ihren Stoffwechsel und verbrauchen anschliessend Glucose als Substrat. Nach diesen 15 Stunden ist es nicht mehr möglich die Zellen wieder an Glutamin zu bringen. Nach 90 h ist also der beste Zeitpunkt für eine Fermenterinokulierung oder um das Feeding-System zu starten. Glutamin- und Glucoseverbrauch Glucoseverbrauch © HiTec Zang GmbH - HRE 50 100 150 200 Fermentationszeit [h]
Beispielfermentationen Medienoptimierung am Beispiel: Osmolalitätsoptimum Tierische Zellkultur Hybridoma (50 mL Kulturvolumen) Das Osmolalitätsoptimum liegt bei 0,318 osmol/kg Wachstumsrate µ [h-1] In diesem Diagramm wird die Wachstumsrate bei unterschiedlichen Mediumsosmolalitäten aufgezeigt. Die maximale Wachstusrate ist die Steigung des OTR in der exponentiellen Phase, da der OTR direkt proportional zum exponentiellen Wachstum ist. Eine größere Steigung in der EXP-Phase im OTR bedeutet eine größere Steigung in der Wachstumsrate. Dies ist ein Besipiel für eine einfache Medienoptimierung bezüglich der Osmolalität. Jede Mediumskomponente, die in ihrer Konzentration einen Einfluss auf die Stoffwechselaktivität hat, kann hier optimiert werden. © HiTec Zang GmbH - HRE Osmolalität [osmol/kg]
Beispielfermentationen Vergleich von RAMOS mit einem Rührkesselfermenter mit Abgasanalytik Tierische Zellkultur Hybridoma Dipl.-Ing. M. Canzoneri Fermentationszeit [h] OTR [mol/(L·h)] 20 40 60 80 Rührkesselfermenter (2 Liter Kulturvolumen) RAMOS (0,05 Liter Kulturvolumen) Dieses Diagramm zeigt den Vergleich zwischen dem OTR in einem gerührten 2-Liter-Bioreaktor und dem RAMOS-SChüttelkolben. Die Verläufe sind nahezu identisch. Dies ist ein starkes Argument für das RAMOS als Ersatz für eine teure Fermentation im Liter-Massstab. Die selben Ergebnisse in einem 40fach kleineren System bedeutet enorme Mediumseinsparung. © HiTec Zang GmbH - HRE
Sauerstofflimitierung Beispielfermentationen Einfluss verschiedener Flüssigkeitsvolumina Bakterium Corynebacterium glutamicum Fermentationszeit [h] Kolben 1 : 10 mL Kolben 2 : 15 mL Kolben 3 : 20 mL Kolben 4 : 30 mL Kolben 5 : 40 mL Kolben 6 : 50 mL Sauerstofflimitierung OTR [mol/(L·h)] Dieses Diagramm zeigt auf, welchen Einfluss Füllstände auf den maximalen Sauerstofftransfer haben. Je mehr ein Kolben mit Flüssigkeit befüllt wird, umso schlechter ist seine Sauerstofftransferrrate. © HiTec Zang GmbH - HRE
Beispielfermentationen Einfluss verschiedener Substratkonzentrationen Bakterium Pseudomonas fluorescens OTR [mol/(L·h)] 1x konzentriert 2x konzentriert 4x konzentriert Fermentationszeit [h] Dieses Diagramm zeigt eine Fermentation des Bakteriums Pseudomonas fluoreszenz. Hier sind die Daten von drei Fermentationen abgebildet, die parallel gewonnen wurden. Die Unterschiede bestehen in unterschiedlichen Mediumskonzentrationen. Einfach, zweifach und vierfach konzentriert. Die Pre-Kultur für die Hauptfermentation hat eine einfache Konzentration. Als erstes erhält man informationen über die Dauer der lag-phase. Das Medium, das identisch mit der Pre-Kultur ist hat die kürzeste lag-Phase, da die Mikroorganismen sich nicht an ein neues Medium adaptieren mussten. Je mehr das Medium sich von der Pre-Kultur unterscheidet, desto länger dauert die lag-Phase, oder die Zeit, die die MOs für die Adaption an ein neues Medium brauchen. Ein anderes Ergebnis ist die geringere maximale Sauerstoffaufnahmekapazität des Mediums, je höher die Konzentration wird. Der Grund ist, dass je mehr das Medium konzentriert ist, die Löslichkeit von Sauerstoff und die maximale Sauerstofftransferrate veringert wird Als letztes möchte ich erwähnen, dass hier auch der osmotische Druck die maximale Wachstumsrate verringer. Dieses Besipiel zeigt sehr gut den Effekt von Mediumvariationen auf die sauerstofftransferrate und wie RAMOS z.B. helfen kann das optimale Ende einer Fermentation zu finden. © HiTec Zang GmbH - HRE
Beispielfermentationen Medium- und Prozessoptimierung Hefe Hansenula polymorpha OTR [mol/(L·h)] Fermentationszeit [h] Medium mit 100% Komp. 1, 30 mL Flüssigkeit Medium mit 200% Komp. 1, 20 mL Flüssigkeit Dieses Diagramm zeigt den Verlauf einer Mediumsoptimierung Die Ausgangssituation ist in der grünen Kurve dargestellt. Der Verlauf lässt eine Substratlimitierung vermuten. Nach Verdopplung der Konzentration of Komponente 1 erhält man die blaue Kurve, die eine Sauerstofflimitierung aufzeigt. Nach Reduzierung der Füllstände erhält man den optimalen Kurvenverlauf © HiTec Zang GmbH - HRE
Beispielfermentationen Zellwachstum innerhalb eines RAMOS-Versuchs Tierische Zellkultur Hybridoma Dipl.-Ing. M. Canzoneri Dieses Diagramm zeigt die Zelldichte zwischen den einzelnen 8 Schüttelkolben in RAMOS auf. Man erkennt, dass die Wachstumsrate in allen 8 Kolben nahezu identisch verläuft. Das Diagramm verdeutlicht die Vergleichbarkeit der 8 Schüttelkolben. © HiTec Zang GmbH - HRE
8-fach Parallelmessung Beispielfermentationen Zellwachstum innerhalb eines RAMOS-Versuchs Tierische Zellkultur Hybridoma Dipl.-Ing. M. Canzoneri Fermentationszeit [h] Zelldichte [N/ml] 40 80 120 160 8-fach Parallelmessung Dieses Diagramm zeigt die Zelldichte zwischen den einzelnen 8 Schüttelkolben in RAMOS auf. Man erkennt, dass die Wachstumsrate in allen 8 Kolben nahezu identisch verläuft. Das Diagramm verdeutlicht die Vergleichbarkeit der 8 Schüttelkolben. © HiTec Zang GmbH - HRE
Handhabungsvorteile Geringer Platzbedarf – RAMOS passt auf einen normalen Labortisch Quasi-Non-Stop-Betrieb durch sehr kurze Rüstzeiten Einfaches und schnell erlernbares Handling Komplett automatisierte Anwendersoftware © HiTec Zang GmbH - HRE
Bedienoberfläche Die Bedienoberfläche der RAMOS-Software ist klar strukturiert. Der Arbeitsverlauf ist durch die Anordnung der Buttons vorgegeben: Neuer Versuch, Parametrieren, ... © HiTec Zang GmbH - HRE
Kolbenübersicht Die Kolbenübersicht zeigt alle 8 RAMOS-Kolben in einem Fenster. Durch das Anklicken des „Vergrössern“-Buttons gelangt man zur Detailansicht eines jeden Kolbens. © HiTec Zang GmbH - HRE
Sauerstofftransferrate (OTR) © HiTec Zang GmbH - HRE
Sauerstofflimitierung Detailansicht für jeden einzelnen Kolben (OTR, CTR, RQ) C-Quelle (Glucose) verbraucht Ethanol verbraucht exp-Phase Sauerstofflimitierung lag-Phase Hier sind die verschiedenen Stoffwechselschritte aufgeführt lag-Pahse Exponetielle-Phase – OTR erreicht Sauerstofflimitierung, Hefe macht Crap-Tree Substratlimitierung – primäre C-Quelle ist verbraucht – CTR fällt steil ab Nach 48 h Umstellung des Stoffwechsels – Hefe veratmet nun Ethanol als C-Quelle – danach wird jedes weitere Substrat verstoffwechselt, was als C-Quelle dienen kann © HiTec Zang GmbH - HRE
O2-, CO2 - Transfer Bilanzierung des gesamten Sauerstofftransfers über den Fermentationsverlauf Sauerstofftransfer (OT) Kohlendioxidtransfer (CT) © HiTec Zang GmbH - HRE
maximale Wachstumsrate µ © HiTec Zang GmbH - HRE Wachstumsrate µ
Bringen Sie Licht in Ihre Prozesse OTR CTR © HiTec Zang GmbH - HRE
Wirtschaftlichkeitsbetrachtung OTR [mol/(L·h)] Fermentationszeit [h] Medium mit 100% Komp. 1, 30 ml Flüssigkeit Medium mit 200% Komp. 1, 20 ml Flüssigkeit Optimierung der Fermentationszeit Amortisationszeit: ca. 6 Monate © HiTec Zang GmbH - HRE Zusatznutzen: Vermeidung von Fehloptimierungen
Zellkultur (Hybridoma) Dosierung Tabellengestützte Dosierprofile. Frei programmierbare Feed-Strategien. © HiTec Zang GmbH - HRE
FTT® Fluid-Train System Dosierung und Probenahme Dosierung und Probenahme durch einen einzigen Schlauch. © HiTec Zang GmbH - HRE
FTT® Fluid-Train System Geregelte Dosierung Feed-Regelung auf den OTR. © HiTec Zang GmbH - HRE
RQFeed™ exakte Fütterung der Kulturen Bestimmung von RQ durch OUR, CER online Messungen exakte Fütterung der Kulturen signifikant erhöhte Produktionsrate Verkürzung der Fermentationszeiten © HiTec Zang GmbH - HRE
CellDrum™ - Zellkraftmessung Reproduzierbare biomechanische Messung Personalisierte Medikamenten- und Toxinforschung Ersatz für Tierversuche Integrierte, vollautomatische und heißsterilisierbare Pipettiereinheit 24 - 96 Multiwell Einheit mit integrierter Sensorik © HiTec Zang GmbH - HRE
HiSense™ - Präzisionsabgasanalytik 1 bis 8(5) Messkanäle für 1 bis 4 Fermenter Hochauflösende Messung (-c Version) Feuchtekorrektur (-c Version) „Echte“ OUR, CER und RQ Messung (-c Version) Geringe Querempfindlichkeit Überdruck möglich Verschleißfreie Sensorik Kompakt Zusatzfunktionen integrierbar Opt. frei programmierbar Viele Kopplungsmöglichkeiten Datenexport möglich © HiTec Zang GmbH - HRE
Zellkultur (Hybridoma) Ohne Dosierung © HiTec Zang GmbH - HRE
Zellkultur (Hybridoma) Dosierung auf OTR geregelt ab RQ < 1 © HiTec Zang GmbH - HRE
Zellkultur (Hybridoma) Dosierprogramm Scriptsprache für Feed-Algorithmen, online Auswertung etc. © HiTec Zang GmbH - HRE
Zellkultur (Hybridoma) Parametrierung der Probenahme © HiTec Zang GmbH - HRE
Kooperationen und Veröffentlichungen Fachhochschule Aachen, Abteilung Jülich Labor für Zellkulturtechnik Prof. Dr. Manfred Biselli Technische Hochschule Aachen, Lehrstuhl für Bioverfahrenstechnik Prof. Dr.-Ing. Jochen Büchs Veröffentlichungen: Weitere Veröffentlichungen auf unserem Download-Portal. Anderlei T., Büchs J., Device for sterile online measurement of the oxygen transfer rate in shaking flasks, Biochem. Eng. J. 7(2), 157-162, 2001 Stöckmann Ch., Maier U., Anderlei T., Knocke Ch., Gellissen G., Büchs J., The Oxygen Transfer Rate as Key Parameter for the Characterisation of Hansenula polymorpha Screening Cultures, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 613-622, 2003 Anderlei T., Zang W., Büchs J., Online respiration activity measurement (OTR, CTR, RQ) in shake flasks, Biochem. Eng. J. 17(3), 187-194, 2004 Lotter St., Büchs J. Utilization of power input measurements for optimisation of culture conditions in shaking flasks, Biochem. Eng. J. 17(3), 195-204, 2004 © HiTec Zang GmbH - HRE Losen M., Lingen B., Pohl M., BüchsJ., Effect of oxygen-limitation and medium composition on Escherichia coli in small-scale cultures, Biotechnol. Progress. (accepted)