Biomolekulare Detektion des Prostatakarzinoms an Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Biomolekulare Detektion des Prostatakarzinoms an minimalen Prostata-Gewebeproben (Biopsien) S. Schneider, J. Seifert, S. Voigt, A. Lohse-Fischer, R. Führer, S. Tomasetti, S. Füssel, M. Haase2, R. Koch3, G.B. Baretton4, M.-O. Grimm1, M. P. Wirth1 Klinik für Urologie, Universitätsklinikum der TU Dresden 2 OncoRay, Zentrum für Medizinische Strahlenforschung in der Onkologie, Dresden 3 Institut für Medizinische Informatik und Biometrie, TU Dresden 4 Institut für Pathologie, TU Dresden

Transkriptquantifizierung ausgewählter Markergene Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Transkriptquantifizierung ausgewählter Markergene 1. Etablierung von qPCR-Assays 2. Analysen an gepaarten RPE-Gewebeproben (Tu&Tf) - Auswertung als Einzelmarker - Markerkombination (3-, 4- & 5-Gen-Modell) - Follow-up (prognostische Aussagen möglich?) 3. Übertragung auf minimale Prostatagewebeproben (RPE-Biopsien und diagnostische Biopsien)

RPE-Biopsien: 47 Patienten (215 RPE-Biopsien) Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider RPE-Biopsien: 47 Patienten (215 RPE-Biopsien) - medianes Alter: 64 Jahre (47 – 76 J.) - medianer prä-OP-PSA-Wert: 6,93 ng/ml (1,5 – 96,09 ng/ml) - histopath. Begutahtung (RPE-Explantat): OCD: 34 Patienten; NOCD: 13 Patienten; 42 pN0, 5 pN1 - genügend RNA aus einer Hälfte der Biopsie: 11 Markergene und TBP (Ref.-Gen) Auswertung: a) Einzelmarker b) Marker-Kombinationen

Relatives Expressionslevel (zmol / zmol TBP) mediane Über-expression Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider RPE-Biopsien: Relatives Expressionslevel (zmol / zmol TBP) Marker-gene malignant (Tu) n = 76 median tumorfrei (Tf) n = 140 P-values (unpaired t-test) mediane Über-expression (Tu vs. Tf) PCA3 AMACR PSGR 54.8 (0 to 181.6) 775.6 (45.2 to 4800.2) 34.4 (0.4 to 228.8) 0.3 (0 to 81.9) 26.1 (9.0 to 640.2) 1.3 (0 to 313.4) < 0.001 172 30 27 Hepsin PSMA TRPM8 PDEF EZH2 PSA Andr.R 0.5 (0 to 2.6) 14.8 (0 to 221.5) 34.1 (0 to 218.0) 23.7 (5.1 to 125.6) 0.5 (0 to 1.8) 394.8 (88.1 to 1994.6) 6.1 (1.8 to 31.8) < 0.1 (0 to 1.0) 1.6 (0 to 72.6) 6.8 (0 to 145.9) 9.0 (0.3 to 89.4) 0.2 (0 to 6.8) 200.7 (0.7 to 10308.1) 4.7 (1.1 to 18.7) 0.542 10 9 5 2 1 Prostein 5.2 (0.6 to 56.8) 5.1 (0 to 45.3) 0.378

4-Genmodell 5-Genmodell Sensitivität: 83% 79% Spezifität: 89% 91% Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Cut-Off 0,65 4-Genmodell 5-Genmodell Sensitivität: 83% 79% Spezifität: 89% 91% PPV: 81% 82% NPV: 91% 89% p < 0,001

3-Genmodell: - neues Modell Hepsin, PCA3 und PSA Cut-off = 1,00: Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider 3-Genmodell: - neues Modell Hepsin, PCA3 und PSA Cut-off = 1,00: Sensitivität: 89 % Spezifität: 81 % PPV: 71 % NPV: 93 % p = 0,151

GSTP1-Methylierungsstatus: Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider GSTP1-Methylierungsstatus: 59 Tu- und 108 Tf-RPE-Biopsien DNA-Isolation und spezifische Umschreibung Messung von GSTP1 und β-Actin als Referenzgen (qPCR) Auswertung: Cut off = 0,20 GSTP1-Methylierung Sensitivität: 88 % Spezifität: 98 % PPV: 96 % NPV: 94 % p < 0,001

Studienpatienten: 64 Patienten mit PCa-Verdacht + 4 Studienbiopsien Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Studienpatienten: 64 Patienten mit PCa-Verdacht + 4 Studienbiopsien 22 Patienten (34%) mit histologisch gesichertem PCa Therapie: RPE: 15 Patienten OCD: 10 (≤ pT2c) NOCD: 5 (pT3a – pT4) Chemoth.: 1 Patient; Brachyth.: 2 Patienten; 4 unbekannt Prostatabiopsien: 237 Feinnadelbiopsien 151 BPH-PB 75 Tf-PB aus PCa-Patienten 11 Tu-PB

relatives Expressionslevel Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Einzelmarker: (105 PB aus 28 Patienten) Marker- gene relatives Expressionslevel (zmol / zmol TBP) med. Überexpr. Tu vs. Tf (x-fach) Mann-Whitney-U-Test two-tailed maligne Biopsien (n = 32) BPH-Biopsien (n = 73) PCA3 PSGR PSA PSMA AMACR PDEF EZH2 TRPM8 AR Prostein Hepsin 0,91 [0-50] 3,73 [0-44] 580,56 [34-1735] 4,83 [0-39] 50,47 [17-466] 18,37 [2-51] 0,18 [0-1] 19,69 [5-66] 6,05 [2-11] 13,37 [2-41] 0,03 [0-1] 0,13 [0-9] 1,97 [0-48] 320,13 [0-2514] 2,74 [0-35] 31,91 [5-183] 12,34 [0-79] 0,13 [0-1] 14,71 [0-81] 5,16 [0-12] 11,70 [0-56] 0,00 [0-1] 7 1,9 1,8 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 n.d. < 0,01 0,44 0,08 0,1 0,01 0,57 0,11 0,20 0,48 0,09

Markerkombinationen: (4- und 5-Genmodell) Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Markerkombinationen: (4- und 5-Genmodell) Cut-off 0,25 Markerkombinationen: (cut-off 0,25) 4-Gene 5-Gene Sensitivität: 61% 58% Spezifität: 75% 88% PPV: 58% 74% NPV: 77% 79%

Markerkombinationen: (3-Genmodell) Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Markerkombinationen: (3-Genmodell) cut-off = 0,3 Markerkombination: mit Cut-off = 0,3 3-Gene Sensitivität: 58 % Spezifität: 72 % PPV: 54 % NPV: 75 % p = 0,032

Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Zusammenfassung: - Hälfte einer Biopsie zur Transkriptquantifizierung von 11 Genen weiteres Material für z.B. Methylierungsuntersuchungen - Markerkombinationen liefern höhere Wahrscheinlichkeiten zur PCa-Vorhersage 4 Markergene + 1 Referenzgen für zusätzliche biomolekulare PCa-Diagnostik Ausblick: biomolekulare PCa-Detektion auf Urinproben übertragen Korrelation der Expressionsdaten mit Follow-up

MuMa (gepaarte Gewebeproben) Follow-up-Daten: (168 MuMa-Patienten Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider MuMa (gepaarte Gewebeproben) Follow-up-Daten: (168 MuMa-Patienten 2 unbekannt verzogen) 2 Hauptgruppen: a) ohne Rezidiv b) mit Rezidiv Rezidiv: PSA > 0,2 ng / ml; PSA-Verdopplg. < 10 Monate Zeit bis Rezidiv (PSA-Anstieg mit nachfolgender Therapie)

MuMa-Gewebeproben (Follow-up) Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider MuMa-Gewebeproben (Follow-up) ohne Rezidiv (95 Patienten; 4 verstorben – nicht an PCa!) - medianes Alter: 65 Jahre (48 – 78 J.) - medianes Follow-up: 56 Monate (19 – 116 M.) - medianes prä-OP-PSA: 8,85 ng/ml (0,24 – 57,24 ng/ml) - medianes post-OP-PSA: 0,04 ng/ml (0 – 2,81 ng/ml) - 68 OCD (72%) und 27 NOCD (28%)

MuMa-Gewebeproben (Follow-up) Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider MuMa-Gewebeproben (Follow-up) b) Rezidiv (73 Patienten; 8 (11%) verstorben – 5 an PCa!) - medianes Alter: 64 Jahre (49 – 75 J.) - medianes Follow-up: 57 Monate (7 – 124 M.) - medianes prä-OP-PSA: 9,70 ng/ml (0,92 – 113 ng/ml) - medianes post-OP-PSA: 0,08 ng/ml (0 – 2,91 ng/ml) - 23 OCD (32%) und 50 NOCD (68%) - mediane Zeit bis Rezidiv: 5 Monate (0 – 96 M.)

Follow-up in Korrelation mit Expressionsdaten I Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Follow-up in Korrelation mit Expressionsdaten I Tf -Kontroll-gewebe Tf-MuMa Nicht-Rezidiv Rezidiv p-Werte (2-teil. t-Test) Tu-Quotient (Rez./ N.Rez.) AMACR 16,20 82,52 1372,52 967,74 0,60 0,71 AR 2,92 7,85 8,86 9,17 0,54 1,03 BCL2 2,10 1,15 0,81 0,87 0,45 1,08 BCLXl 16,93 12,42 14,91 14,46 0,66 0,97 D-GPCR - 1,22 2,87 3,59 0,75 1,25 EZH2 0,17 0,39 0,80 0,88 0,35 1,10 Hepsin 0,00 0,07 0,59 0,51 0,99 Ki67 0,77 0,32 0,58 0,01 1,39 PCA3 43,50 23,70 0,11

Follow-up in Korrelation mit Expressionsdaten II Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Follow-up in Korrelation mit Expressionsdaten II Tf -Kontroll-gewebe Tf-MuMa Nicht-Rezidiv Rezidiv p-Werte (2-teil. t-Test) Tu-Quotient (Rez./ N.Rez.) PCGEM1 0,11 0,69 0,81 0,40 0,23 0,50 PDEF 2,57 12,44 24,70 21,57 0,02 0,87 Prostein 1,64 11,00 15,47 12,40 0,00 0,80 PSA 36,83 194,35 342,97 262,28 0,03 0,76 PSGR 5,96 42,26 43,72 0,52 1,03 PSMA 0,28 4,12 24,68 29,49 0,15 1,19 Survivin 0,61 0,18 0,27 1,51 TRPM8 6,92 7,59 35,88 28,57 XIAP 13,19 14,70 20,93 17,47 0,08 0,83

Routine: i. R. 12 bis 24 Biopsien bei PCa-Verdacht Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Biopsie-Entnahme: Routine: i. R. 12 bis 24 Biopsien bei PCa-Verdacht 1.) Biopsien aus Poliklinik (Haus 28; Endo-Saal) Re- /Biopsien; Anruf, wenn Patient zugestimmt hat zuständig: Dr. Heberling, Hr. Rentschler, Dr. Rippel 2.) Biopsien aus Haus 8 (TUR- oder Saal 4 [Röntgen]) meist Re- und Sättigungsbiopsien, auch in Narkose Anruf, wenn Patient zugestimmt hat und bereit ist zuständig: meist Fr. Voigt

unter Trans-Rektalem-UltraSchall (TRUS) Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider unter Trans-Rektalem-UltraSchall (TRUS) 12er Biopsie-Schema: (12 Kassetten) 1.) rechts apikal zentral 2.) rechts apikal peripher 3.) rechts Mitte zentral 4.) rechts Mitte peripher 5.) rechts basal Mitte 6.) rechts basal peripher 7.) links apikal zentral 8.) links apikal peripher 9.) links Mitte zentral 10.) links Mitte peripher 11.) links basal zentral 12.) links basal peripher

unter Trans-Rektalem-UltraSchall (TRUS) Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider unter Trans-Rektalem-UltraSchall (TRUS) 12er Biopsie-Schema: (12 Kassetten) 1.) rechts apikal zentral 2.) rechts apikal peripher Studienbiopsie 3.) rechts Mitte zentral 4.) rechts Mitte peripher 5.) rechts basal Mitte 6.) rechts basal peripher Studienbiopsie 7.) links apikal zentral 8.) links apikal peripher Studienbiopsie 9.) links Mitte zentral 10.) links Mitte peripher 11.) links basal zentral 12.) links basal peripher Studienbiopsie

Prostatabiopsie von Nadel auf Filterpapier ziehen, Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Prostatabiopsie von Nadel auf Filterpapier ziehen, ggf. Lage korrigieren (planar, gerade) in fl. Stickstoff tauchen, dann ins Röhrchen legen (wiederum in fl. Stickstoff) Stickstoffbehälter + 4 zusätzliche Biopsien und Routinebiopsien mit (unterschriebenen) Patho-Anforderungsschein mitnehmen Lagerung bei -80 °C bis Kryoschneiden ein Patho-Eingang: Routine-Biopsien + Mappe mit 4 OT (je 6 Schnitte)

Statistik: (diagnostische Prostatabiopsien) Stand 21.Mai 2008 Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Statistik: (diagnostische Prostatabiopsien) Stand 21.Mai 2008 Beginn der Studie: Juni 2006 aktuelle Anzahl: 71 Patienten Jahr 2006: 19 Patienten 18 Pat. ohne Elastographie 1 Pat. mit Elastographie gekoppelt Jahr 2007: 46 Patienten 18 Pat. ohne Elastopraphie 28 Pat. mit Elastographie gekoppelt Jahr 2008: 6 Patienten 6 Pat. mit Elastographie gekoppelt

Statistik: (Urinproben) Stand 21.Mai 2008 Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider Statistik: (Urinproben) Stand 21.Mai 2008 Beginn der Studie: 28.April 2008 aktuelle Anzahl: 26 Patienten Woche: 5 Patienten vor RPE Woche: 8 Patienten vor RPE Woche: 3 Patienten vor RPE Woche: 8 Patienten vor RPE

nur PCA3: RPE-Biopsien: Sensitivität: 87% Spezifität: 88% PPV: 79% Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider nur PCA3: RPE-Biopsien: Sensitivität: 87% Spezifität: 88% PPV: 79% NPV: 93%

nur PCA3: diagnost. Biopsien: Sensitivität: 61% Spezifität: 73% Klinik und Poliklinik für Urologie Medizinische Fakultät der TU Dresden Susanne Schneider nur PCA3: diagnost. Biopsien: Sensitivität: 61% Spezifität: 73% PPV: 57% NPV: 76%