Immunologisches Labor Refresher Kurs zur Vorbereitung eines Kolloquiums bei der KV 1 1 1

Facharztweiterbildung Nuklearmedizin Weiterbildungsinhalt: Erwerb von Kenntnissen, Erfahrungen und Fertigkeiten in ... … der nuklearmedizinischen in-vivo- und in-vitro-Diagnostik unter Verwendung von organ-/zielgerichteten Radiodiagnostika … … der Radiochemie und der gebietsbezogenen Immunologie und Radiopharmakologie 2 2 2

Juristische Voraussetzungen Laborrichtlinien KBV 5/1994 Nuklearmediziner : RIA (entspr. Weiterbildung/Zeugnis) Bei NON-RIA : Prüfung Fachkommission Schriftwechsel KBV 2005 Immunologische Parameter unabhängig von Methode ( RIA , LIA , FIA etc ) durch Nuklearmediziner abzurechnen , falls Weiterbildung vorliegt 3 3 3

Fachliche Aspekte Laborkolloquium Fragenkatalog Angaben von Kollegen von der KV eingesetztes Gremium 3-4 Mitglieder ( mind. 1 Laborarzt ) Fragenkatalog Angaben von Kollegen 4 4 4

Inhalt Kolloquium Immunologische Methoden Rili-BÄK RIA, LIA, FIA Immunologisches Testprinzip Interpretation der Ergebnisse Rili-BÄK Qualitätsmanagement Qualitätssicherung

Immunologische Messmethoden 41. Jahrestagung des BDN Immunologische Messmethoden Nürnberg, September 2012 Dr. Hermann Butz, Drei-G-Consulting In Kooperation mit: Euro-Labor-Freiburg 6 6 6

L. Thomas: Labor und Diagnose: 7. Auflage, Empfohlene Literatur Sokolowski/Wood: Radioimmunoassay in Theorie und Praxis: nur noch antiquarisch erhältlich L. Thomas: Labor und Diagnose: 7. Auflage, gebraucht ca. 100 € bei Amazon, Kapitel 52.1: Immunchemische Techniken (S. 1915 – 1936) Packungsbeilagen der jeweiligen Teste Ausführlicheres Vortragsscript: Euro-Labor Freiburg schwabe@euro-labor-freiburg.de oder hermann.butz@drei-g-consulting.de 7 7 7

Klassisches Anwendungsgebiet von Immunoassays: Hormonanalytik Hormonanalytik von Körperflüssigkeiten (in-vitro, ohne Probenaufbereitung) Spezifischer Nachweis von Hormonkonzentrationen in Anwesenheit vieler anderer, zum Teil sehr ähnlicher Moleküle:  hohe Spezifität gefordert  Schlüssel-Schloss-Prinzip von Antigen-Antikörper-Reaktionen Nachweis extrem niedriger Konzentrationen (10-6 bis 10-16 mol):  hohe Signalstärke gefordert = hohe „spezifische Aktivität“ des Signalträgers gefordert  125J (später weitere Signalträger: Enzyme, Fluoreszenz, Luminesz.) Erster Immunoassay: R. Yalow/S. Berson (1959): Nobelpreis 1977 Insulin-RIA, (kompetitiver IA, homogen) Heutiger Standard-IA: Sandwich-Immunoassay (nicht-kompetitiver IA, heterogen) 8 8 8

„Teilnehmer“ eines Immunoassay Antigene (Analyte = zu bestimmende Substanz): Hormone (Proteohormone, Steroidhormone,...), Medikamente, .... Antikörper: Y-Form mit Fab-Teil (Antigenspezifisch) und Fc-Teil (Speziesspezifisch), bindet spezifisch an „Ziel“-Antigene Antigene und Antikörper bilden Ag-Ak-Komplexe nach dem Schlüssel-Schloss-Prinzip Ag-Ak-“Reaktionen“ folgen dem Massenwirkungsgesetz (Ag-Ak) Ag + Ak  Ag-Ak Affinitätskonstante K = ------------------- (Ag) x (Ak) hohe Affinitätskonstante = feste Bindung von Ag und Ak  Hohe Analytische Sensitivität möglich 9 9 9

Bestandteile eines (Sandwich-)Immunoassays Gesucht: variable Konzentration eines Ag Messbar über: konstante Zahl von Ak im Immunoassay Markierung des Ak  AkÜberschuss Komplexbildung: Ag + AkÜberschuss  Ag-Ak + Ak Trennung von gebundener Phase Ag-Ak und freier Phase Ak  gesuchte Antigenkonzentration = Menge des Signals in der gebundenen Phase = Ag-Ak 10 10 10

Festphase (Solid Phase): Röhrchenwand Kaverne einer Mikrotiterplatte Moderne, heterogene IA: Vorwegnahme der Trennung von freier und gebundener Phase durch Kopplung eines Ak an eine Festphase Wash Gebundene Phase Freie Phase Festphase (Solid Phase): Röhrchenwand Kaverne einer Mikrotiterplatte Kügelchen Magnetische Partikel, Latex-Partikel, Glas-Partikel,.... Je kleiner und „beweglicher“ die Festphase, umso kürzer die Inkubationszeit 11 11 11

Markierung eines Ak mit geeignetem Signalträger Wash Signalgeber (Tracer): Radioaktivität (125J, 3H: Gammacounter; 1-10 Minuten) Enzyme (farblose Substrate  farbige Produkte: Photometer (Lambert-Beer‘sches Gesetz; 10-20 Min.)) Lumineszenz (Acridiniumester, Luminol, (Enzym: Alkalische Phosphatase katalysiert Lichtreaktion): Luminometer; 1- 60 sec.) Fluoreszenz (Fluorophore: Fluorometer; 1 sec.) 12 12 12

Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....) _ E Signalarten RIA, IRMA, _ 125J Gammacounter Wash EIA, IEMA Farblose Substrate Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....) _ E 10 – 20 Minuten (MPO) Farbige Produkte LIA, ILMA Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott _ H2O2 + NaOH AE AE‘ + Licht (1-2 sec.) LIA, ILMA _ Anregende Elektrode Elektro-CL: Roche TR Licht MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2‘-bipyridyl)-Ruthenium 13 13 13

Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....) _ E Signalarten Keine der verschiedenen Signalarten (125J, Enzym, Fluorophor, Luminophor) ist in der Summe aller Eigenschaften der anderen eindeutig überlegen RIA, IRMA, _ 125J Gammacounter Wash EIA, IEMA Farblose Substrate Meist manuelle EIA: viele Hersteller (Fujirebio, DSL,....) _ E 10 – 20 Minuten (MPO) Farbige Produkte LIA, ILMA Direkte CL: Siemens-Centaur, Abbott _ H2O2 + NaOH AE AE‘ + Licht (1-2 sec.) LIA, ILMA _ Anregende Elektrode Elektro-CL: Roche TR Licht MPO = Meerettich-Peroxidase, AP = Alkalische Phosphatase, ADP = Adamantyl-Dioxetan-Phosphat, AE = Acridinium-Ester, TR = Tris-(2,2‘-bipyridyl)-Ruthenium 14 14 14

EIA oder LIA oder FIA vs. RIA Was unterscheidet einen RIA von den anderen IA NUR die Signalart, sonst ist alles gleich !!! Wer eine RIA abarbeiten und die Ergebnisse im klinischen Kontext bewerten kann, der kann auch mit nicht-Radioaktiven IA korrekt umgehen. Welche konstruktiven Varianten von IA (RIA, EIA, LIA, FIA) gibt es ? Nicht-Kompetitive IA vs. Kompetitive IA = IRMA vs. RIA 15 15 15

Bestandteile eines IA, Ablauf Wash „Standard“-Sandwich-Immunoassay: IRMA (Immun-RadioMetrischer Assay) Ak1 an Festphase Ak2 mit Signalträger (125J, andere Signalträger: analog) Inkubation mit Probenantigenen Waschschritt Messung 16 16 16

Y Y Darstellung der Ag-Ak-Komplexe Bisherige Darstellung Vereinfachte Darstellung 17 17 17

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Wash Y ............. ............. Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK1 im Überschuss Signal-AK2 im Überschuss 18 18 18

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Wash Y ............. Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 ............. Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK1 im Überschuss Analyt im Unterschuss Signal-AK2 im Überschuss 19 19 19

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Wash Y ............. Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 ............. Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK1 im Überschuss Analyt im Unterschuss Signal-AK2 im Überschuss 20 20 20

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Wash Y ............. Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 0 1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1 Maximales Signal ............. ............. Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und proportional ansteigende Standardkurve (Steigung: 1) SP-AK1 Analyt Signal-AK2 21 21 21

Sandwich-Immunoassay im mathematischen Modell: Störung eines IRMA: High-Dose-Hook-Effekt Wash Y ............. Bei extremen Analytkonzentrationen (z.B. hCG bei Blasenmole) steigt die Zahl von „einzelnen“ AK-Ag-Komplexen (vgl. Heidelberger Kurve) = eine steigende Anzahl von Ag-Signal-Ak-Komplexen wird weggewaschen. Das Mess-Signal (SP-AK1-Ag-Signal-Ak2) sinkt trotz steigender Analytkonzentration. Ein Signal (hier: relatives Signal „3“) kann zu mehreren Konzentrationen gehören (relative Konzentration „3“ oder zu einer extrem hohen Konzentration x). Hilfe: Wash nach SP-Ak1-Ag-Inkubation oder Verdünnungen herstellen und vermessen Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 0 1 2 3 4 6 5 4 3 2 1 Maximales Signal ............. ............. ............. .. .. x SP-AK1 im Unterschuss Analyt im hohen Überschuss Signal-AK2 im Unterschuss 22 22 22

Sandwich-Technik für alle Antigene geeignet ?  NEIN !!! Bestimmung von Steroiden oder Schilddrüsenhormonen ? Östradiol: MG 272,3 Da T4: MG 776,9 Da Sehr kleine Analyte haben nur 1 Epitop,  Bindung eines zweiten (Signal-) Antikörpers an den Analyten ist nicht möglich  andere Assaytechnik ist gefordert  Markierung des Antigens (Assay-Ag: Ag )  kompetitive Immunoassays Solid Phase 23 23 23

Kompetitive Immunoassays: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Gesucht: Konzentration des Analyten in der Probe via Ag Prinzip: Proben-Antigen und markiertes Assay-Antigen konkurrieren um die Bindungsplätze am Antikörper und belegen sie entsprechend ihrer Konzentrationsverhältnisse. Das Messsignal ist am höchsten, wenn kein Probenantigen vorhanden ist. Mit steigender Anzahl von Probenantigen werden immer mehr markierte Assay-Antigene verdrängt und das Messignal sinkt:  Konzentrationsbestimmung möglich! Y SP-AK 24 24 24

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 Y SP-AK 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss 25 25 25

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 Wash Y SP-AK 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss 26 26 26

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Ag-Probe Ag-Assay Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 Y Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK im Unterschuss Markierter Analyt im Überschuss Analyt in der Probe 27 27 27

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 Wash Y Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) Konzentrationsverhältnis: 2 : 6 = 1 : 3 0 1 2 3 4 5 6 SP-AK im Unterschuss Analyt in der Probe Markierter Analyt im Überschuss 28 28 28

Kompetitive Immunoassays im mathematischen Modell: Ablauf, Eichkurve, Konzentrationsbestimmung Wash 0 1 2 3 4 5 6 Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 Flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision) Y Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) Konzentrationsverhältnis: 18 : 6 = 3 : 1 SP-AK im Unterschuss Analyt in der Probe Markierter Analyt im Überschuss 29 29 29

Sandwich-IA vs. kompetitiver IA = IRMA vs. RIA Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 0 1 2 3 4 5 6 6 5 4 3 2 1 0 1 2 3 4 5 6 Relatives Signal Relative Konzentration: Standards (Analyt) 6 5 4 3 2 1 IRMA: Relative untere Nachweisgrenze: 1 Linear und steil ansteigende Standardkurve (= sehr gute Präzision) Breiter Messbereich (Ak1,2-Erhöhung) mit sehr guter Präzision RIA: Relative untere Nachweisgrenze: 2 (!) flache, nicht-lineare Standardkurve (= schlechtere Präzision) eingeschränkter Messbereich mit akzeptabler Präzision 30 30 30

RIA‘s unterscheiden sich (eigentlich) nicht von anderen IA Zusammenfassung: Ist der Analyt ein Hapten: Kompetitiv = RIA Ist der Analyt groß genug: Nicht-Kompetitiv = IRMA Gute Sensitivität Gute Präzision Weiter Messbereich Gute Spezifität Schnell Sehr gute Sensitivität Sehr gute Präzision Sehr weiter Messbereich Sehr gute Spezifität Sehr schnell Verschiedene (+/- gleichwertige) Signalarten RIA‘s unterscheiden sich (eigentlich) nicht von anderen IA 31 31 31

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit ! 32 32 32

Rili-BÄK Aktuell = 4. Richtlinie der Bundesärztekammer zur Qualitätssicherung laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen (gültig seit 15.02.2008) Sie gilt für jeden, der analytische Messungen durchführt und stellt eine Vielzahl komplexer Anforderungen an das Management und das Personal in Laboren und Praxen! Der heutige Fokus liegt auf Teil A und Teil B1 der Rili-BÄK: Teil A betrifft die grundlegenden Anforderungen an die Qualitätssicherung Teil B1 die QS quantitativer laboratoriumsmedizinischer Untersuchungen 33 33 33 33

Rili-BÄK Teil A der Richtlinie fordert die Erstellung eines umfassenden Qualitätsmanagement-Systems zur Regelung der folgenden Bereiche: Struktur (Organigramm, Zuständigkeiten…) Technische- und Personelle Ressourcen (Räume, Ausrüstung…) Präanalytik (Gewinnung, Transport, Vorbereitung Probenmaterial…) Analytik (Standardisierte Arbeitsanleitungen, Validierte Untersuchungsverfahren…) Postanalytik (technische und medizinische Validation, Laborbericht…) Qualitätsmanagementhandbuch (QM-Ziele & Strategien, Arbeitsprozesse…) Dokumentenlenkung (Versions-Nr., Freigabe, Schulung…) Umgang mit Beschwerden (Dokumentation, Korrekturmaßnahmen…) Fremdlaboratorien (Versanddokumentation, Kontrolle…) Fehlerhaften Untersuchungsergebnisse (Verfahrensbeschreibung…) 34 34 34

Rili-BÄK Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interne und externe QS Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a 35 35 35

Rili-BÄK Interne QS: alle vom medizinischen Laboratorium durchgeführten quantitativen Untersuchungen unterliegen der internen Qualitätskontrolle 36 36 36

Rili-BÄK Teil B1 der Richtlinie beschriebt die interne und externe QS Siehe hierzu: Auszug aus der Tabelle B 1 a 37 37 37

Rili-BÄK Konsequenz bei nicht Einhaltung der zulässigen relativen Abweichung Überschreitet ein Kontrollprobeneinzelmesswert die vorgegebene Fehlergrenze, ist das Messverfahren vorläufig gesperrt; es muss nach der Ursache der Abweichung gesucht und diese beseitigt werden; die Messung wird wiederholt. Überschreitet der relative quadratischen Mittelwert der Messabweichung (QMDM) einer Kontrollprobe, den in Tabelle B1a-c/Sp3 angegebenen oder den laborintern ermittelten Wert, ist das Untersuchungsverfahren für weitere Messungen von Patientenproben zu sperren. Das Messverfahren kann erst dann wieder freigegeben werden, wenn die Funktionsfähigkeit des Verfahrens durch geeignete Maßnahmen festgestellt wurde. Alle QS- Maßnahmen müssen lückenlos dokumentiert werden. 38 38 38

Rili-BÄK Externe Qualitätssicherung (Ringversuche) Für alle durchgeführten Analysen, der in Tabelle B1 a-c aufgeführten Parameter, ist die Teilnahme an einem Ringversuch pro Quartal Pflicht. Die vollständige Richtlinie (incl. Tabelle B1a bis c) erhalten Sie auf der Homepage der Bundesärztekammer unter www.bundesaerztekammer.de Für weitere Informationen und/oder die Zusendung des Scripts können Sie gerne Frau Regina Clotten (QMB euro-labor) unter der E-Mail Adresse: clotten@euro-labor-freiburg.de kontaktieren. 39 39 39 39

Kooperations-Möglichkeiten Kostenbetrachtung Reduzierung der Vergütung für SD-Parameter (GKV-EBM) 2000 und 2006 um je 30-60 !!! „Herstellungskosten“ für Immunologische Parameter konstant / steigend (Personal, Geräte, Miete...) Rili-BÄK – Zusätzliche Kosten!!! Teil A: Qualitätsmanagemant (Handbuch etc.) Teil B: Interne + Externe Qualitätskontrollen z.B. 15-20 SD-Patienten/Tag >> 20 – 30.000,- € Kosten/Jahr 40 40 40

Q u a l i t ä t v o r W i r t s c h a f t l i c h k e i t Kooperations-Möglichkeiten Optimale Teste für SD-Parameter (unabh. Von Methode, Preis etc.) > Eigenständiges Immunologisches Labor > Mehrere Analysegeräte für unterschiedliche SD-Parameter > Auswahl nach aktueller Qualität (Genauigkeit, Reproduzierbarkeit, Ablauf etc.) > Kontroll-Möglichkeiten für jeden einzelnen einsendenden Arzt Q u a l i t ä t v o r W i r t s c h a f t l i c h k e i t 41 41 41

Immunologische Laboratorium-Untersuchung Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung I Ärztlich Untersuchungsentscheidung (Indikation) II Präanalytik III Laboratoriumsmedizinische Analyse IV ärztliche Beurteilung 42 42 42

Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung Immunologische Laboratorium-Untersuchung in eigener Praxis Indikationsstellung, Präanalytik (Schritt I+II) Qualitätsprüfung (Korrelation mit anderen Parametern, Verlauf, Therapiebeeinflußung etc.) Befundung (Schritt IV) 43 43 43

„im ausgelagertem Labor“ Kooperations-Möglichkeiten Immunologische Laboratorium-Untersuchung Immunologische Laboratorium-Untersuchung „im ausgelagertem Labor“ Technische Leistung (Schritt III) = Laboratoriumsmedizinische Analyse (zentral erbracht) 44 44 44

Kooperations-Möglichkeiten Eigenständiges Abrechnen Modell „Immunologie Freiburg“ Erste von der KV genehmigte überörtliche Leistungserbringergemeinschaft zur Erbringung immunologischer Untersuchungen in Deutschland Schritte I, II, IV in eigener Praxis Schritt III in Rahmen „Immunologie Freiburg“ 45 45 45

eigenständiges Abrechnen Kooperations-Möglichkeiten eigenständiges Abrechnen Systematik des §15 Abs. 3 BMW-Ä: Die Leistung wird als eigene Leistung desjenigen Arztes abgerechnet, wenn Schritt 1, 2, 4 in eigener Praxis und Schritt 3 in Rahmen der Leistungserbringergemeinschaft „Immunologie Freiburg“ im Auftrag des Arztes durch einen anderen erbracht wird. Mitgliedschaft in „Immunologie Freiburg“ bedeutet eigenständige Leistungserbringung! 46 46 46