Welches Protein ist gesucht? 1982?

Rekombinante Proteinexpression in Eukaryoten Viktoria Meinhold, 7. Juni 2019 Bachelorstudiengang Chemie

Warum eukaryotische Expressionssysteme? Vorteil prokaryontischer Expressionssysteme (am Bsp. Escherichia coli):  heterologe Proteine aus rekombinierten cDNAs  fundiertes Wissen  schnell und kostengünstig

Warum eukaryotische Expressionssysteme? Nachteil prokaryontischer Expressionssysteme (am Bsp. E.coli):  Proteine oft instabil und/oder biologisch inaktiv  eprimierte Proteine oft verunreinigt  oft pyrogene/toxische Wirkung auf Zielorganismus  posttranslationale Modifikationen?

Beispiele für posttranslationale Modifikationen Disulfidbrücken Proteolyse von Vorstufenformen

Beispiele für posttranslationale Modifikationen Glykolisierung

Modifikation funktioneller Gruppen der Aminosäuren in einem Protein Phosphorylierung

Modifikation funktioneller Gruppen der Aminosäuren in einem Protein Acetylierung

Modifikation funktioneller Gruppen der Aminosäuren in einem Protein Hydroxylierung Abb.: Kollagen-Tripelhelix Abb.: 4-Hydroyprolin

Modifikation funktioneller Gruppen der Aminosäuren in einem Protein Acylierung zahlreiche weitere Modifikationen!

Merkmale eukaryotischer Expressionsvektoren Selektierbares Markergen Promotorsequenz Stopsignale für Transkription und Translation Signalsequenz für Polyadenylierung des mRNA-Transkripts 2 Möglichkeiten: Vektor als Plasmid oder soll chromosomale DNA in die der Wirtszelle integrieren

Allgemeiner Aufbau Euk- Expressionseinheit: Promotor (p), Klonierungsstelle (ks) für Fremdgen, DNA-Abschnitt mit Terminations- und Polyadenylierungssignalen (t) Euk., selektierbares Markergen-system (EMS) Replikationsstartpunkt für euk. Zellen (orieuk) Replikationsstartpunkt für E. coli (oriE) Selektierbares Markergen f. E. coli (ampR)

Beispiel für Expressionssysteme: Hefe „Saccharomyces cerevisae“ Impfstoffe HIV-1-Hüllprotein Diagnostika Therapeutisch wirksame Proteine für Menschen Warum Hefe?

Warum überhaupt weiterforschen? oft geringe Expressionsraten Verluste von Plasmiden bei „scale-up“ oft Hyperglykolisierung schwieriger Aufreinigungsprozess

Beispiele für rekombinante Proteine Hyaluronidase (Hyal-1) Oberflächenantigen (SAG2) von Toxoplasma gondii Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP)

Literatur [1] B.R. Glick, J.J. Pasternack in Molekulare Biotechnologie, Spektrum Akademischer Verlag GmbH Heidelberg.Berlin.Oxford, 1995, S. 125-143 [2] Sodoyer, R. 2004. Expression systems for the production of recombinant pharmaceuticals. BioDrugs : clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals and gene therapy 18, 1, 51–62. [3] Dissertation von Claudia Lieselotte Ella Fritsche „„Untersuchungen zur optimalen Kultivierung von Leishmania tarentolae“ [4] https://de.wikipedia.org/wiki/W%C3%BCrfelzucker#/media/File:W%C3%BCrfelzucker_-- _2018_--_3582.jpg [5] S. Craft, L. D. Baker, T. J. Montine et al.: Intranasal insulin therapy for alzheimer disease and amnestic mild cognitive impairment: A pilot clinical trial. In: Archives of Neurology. Band 69, Nr. 1, Januar 2012, S. 29–38 [6] http://www.tugendheim.de/diabetes/definition/begriff/insulin.html

Literatur [7] www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/ proteine/konjugierte_proteine.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/proteine/funktion_v_prot/konj ugierte_proteine/glyco_verknupf2.vscml.html [8] https://www.pharmazeutische-zeitung.de/ausgabe-412017/der-zuckerpool-im- nebenjob/ [9] https://www.hoelzel-biotech.com/de/infothek/protein-modifikationen/ [10] https://www.spektrum.de/lexikon/biologie/acylierung-von-proteinen/887 [11] https://www.biologie-seite.de/Biologie/Polyadenylierung [12] http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/proteine /strukturproteine.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/proteine/funktion_v_prot/struktur/modif2_kolla gen.vscml.html