Protein Aufreinigung - Proteomik Leipzig, 07.06.2019 Zocher, Christian

Protein Expression Bevor Aufreinigung, woher Protein? Bzw was aufreinigen? - DNA chemisch herstellen, in Zellen splicen (Plasmide) - Vermehren der Zellen, Protein Expression anregen (Zellen Prod. Protein) - Aufreinigung (wird jetzt näher erklärt), Analytik

Ultrazentrifugation Zonenzentrifugation Isopyknische Zentrifugation Saccharose als Gradientenbildner CsCl als Gradientenbildner LM = Wasser Trennung nach Dichte Trennung nach isopyknischem Punkt Trennen von Teilchenmassen g/mol = 200-1200 ~150.000 U/min; 1mio. g 1. Sedimentationsgeschwindigkeit bestimmen 2. Diese Ausnutzen, um das gewünschte Produkt zu Sedimentieren Beeinflussende Eigenschaften: Dichte, Volumen, Stuktur 2 Arten: Zonenzentrifugation Saccharose Lösung (Gradientenbildner) in Zentrifugenröhrchen. Besitzt einen Dichtegradiente (gebrauchsfertig zu kaufen) Moleküle wandern bis zum Dichtegleichgewicht mit dem Gradientenbildner Es bilden sich Banden, entsprechend der Dichte der einzelnen Verbindungen isopyknische Zentrifugation (isopyknisch = Flüssigkeitsschicht gleicher Dichte) CsCl Lösung als Gradientenbildner Dabei Probe mit CsCl Lösung vermischen. CsCl bildet einen Dichtegradienten bei der Zentrifugation Moleküle wandern zu ihrem entsprechenden isopyknischen Punkt innerhalb dieses Gradienten http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/9/mac/charakterisierung/d3/ultrazentrifuge/ultrazentrifuge.vlu/Page/vsc/de/ch/9/mac/charakterisierung/d3/ultrazentrifuge/sedimentation.vscml.html

Dialyse Trennung nach Proteingröße Beruht auf Osmose Zur Entsalzung von Proteinen Beginn Gleichgewicht Protein in Lösung in Dialyseschlauch geben (=Semi Permeable Membran) Schlauch zuknoten (mit Klammer zuklemmen) Schlauch in Lösung hängen Mehrfaches Pufferwechseln -> vollständige Entsalzung Bei geringen Temperaturen wegen Proteinstabilität Selten genutzt um verschiedene Proteine voneinander zu trennen https://en.wikipedia.org/wiki/Dialysis_(biochemistry)

Löslichkeit Zugabe von Salzen hoher Ionenstärken MgCl2, (NH4)2SO4 Konkurrenz um Lösungsmittel-moleküle Abnahme Solvathülle um Proteine Passive Konzentrationser-höhung Aggregation bis zur Ausfällung (Auskristallisation) Aussalzen von Proteinen Protein in entsprechender Salzlösung (Salz und Wasser) lösen (Puffer) Langsam mehr Salz zugeben (c erhöhen) - Dabei darf kein Bodensatz entstehen! Nicht umrühren, um Kristallbildung zu unterstützen - Zeitaufwendiges Verfahren. Kristallwachstum geschieht nicht sofort! https://slideplayer.org/slide/216992/1/images/8/%28Dissoziation%2FHydration%29.jpg

Löslichkeit 1 Lösen Protein in Ammoniumsulfat Lösung (1) Zugabe hochkonzentrierter Ammoniumsulfat Lösung Wasser Diffusion von (1) nach (2) Aufgrund Konzentrations-unterschied Erhöhung Konzentration in (1) Langsames Auskristallisieren des Proteins (geringere Löslichkeit) Kristallisation von Proteinen 2 Protein in Pufferlösung lösen (oft (NH4)2SO4 Lösung aufgrund zusätzlich Protein stabilisierender Effekte) Lösung auf einen Glasstab geben (in diesem ist eine Kuhle) Dieser befindet sich in einer geschlossenen Glaskammer (Ähnlich zu einer DC Kammer) Den Boden mit einer sehr hoch konzentrierten Salzlösung bedecken (wahlweise gesättigter Lösung) Aufgrund von Konzentrationsunterschied der Lösung und Dampfdruck von H2O Wasser diffundiert von (1) nach (2) (osmotischer Druck) Konzentration an Protein im Tropfen steigt. Dadurch agglomerieren Proteinmoleküle Keimbildung und anschließendes Kristallwachstum Beeinflussung durch: - Temperaturerhöhung/Senkung (ungerne, aufgrund von Proteinstabilität, Denaturierung Protein) - Druck (häufiger, aber nur sehr geringe Differenzen. Gleiche Probleme, Denaturierung) https://docplayer.org/11348741-Vom-ei-zum-proteinkristall-reinigung-und-kristallisation-von-lysozym.html

Chromatographie Tag an Protein erforderlich Ligand Zielprotein (Tag) Affinitätschromatographie Tag an Protein erforderlich Ligand Zielprotein (Tag) Glatathion S-Transferase (GST) Glutathion (GST-Tag) Avidin, Streptavidin Streptavidin-Tag Metallionen (Na2+-NTA) His6-Tag https://www.mobitec.com/cms/products/bio/10_lab_suppl/MoBiTec_Ni_IDA_Columns.html

Chromatographie Ligand Zielprotein (Tag) Alkane (Octan) Unpolar Hydrophobic Interaction Chromatographie (HIC) Ligand Zielprotein (Tag) Alkane (Octan) Unpolar Arryle (Phenyl) schwach Polar stationäre Phase mobile Phase Agarose Wasser Silica Salzlösungen Organische Polymere (NH4)2SO4 und Na2SO4 sind am meisten verwendet in mobiler Phase (Stabilisieren Proteine) https://www.mobitec.com/cms/products/bio/10_lab_suppl/MoBiTec_Ni_IDA_Columns.html

Zusamenfassung Verfahren Anwendungsgebiet Ultrazentrifugation Trennung einer Probe mit Molekülen (stark) unterschiedlicher Dichten Dialyse Entfernen von Salzen aus einem gereinigten Protein Aussalzen Reinigen eines Proteins durch Kristallisation aus einer Lösung Auskristallisieren Kristallisation eines gereinigten Proteins Affinitätschromatographie Trennung eines getagten Proteins von Verunreinigungen HIC Trennung eines Proteins nach Polarität

Quellen https://www.rct-online.de/magazin/proteinreinigung-durch-dialyse/ http://www.chemgapedia.de/vsengine/vlu/vsc/de/ch/1/pc/pc_09/pc_09_02/pc_09_02_01.vlu/Page/vsc/de/ch/1/pc/pc_09/pc_09_02/pc_09_02_05.vscml.html https://www.spektrum.de/lexikon/biochemie/dialyse/1653 http://www.chemgapedia.de/vsengine/tra/vsc/de/ch/8/bc/tra/proteine.tra/Vlu/vsc/de/ch/8/bc/vlu/proteinanalytik/proteinfaellung.vlu/Page/vsc/de/ch/8/bc/proteinanalytik/methoden_protein/fallung_aussalzen.vscml.html https://www.spektrum.de/lexikon/biologie/proteinkristallisation/54154 https://slideplayer.org/slide/216992/ Heinz Bende: Affinitäts-Chromatographie. In: Chemie in unserer Zeit. Band 8, Nr. 1, 1974, S. 17–25 http://www.ispybio.com/search/protocols/purification%20protocol12.pdf

Vielen Dank! Zocher, Christian Institut für Biochemie www.uni-leipzig.de