Universitätsklinik für HNO, Kopf- und Halschirurgie Vielfalt der Zellen - Integration ins hörgeschädigte Ohr Dr. med. Pascal Senn Venerable Session Chairman Venerable colleagues, ladies and gentlemen I would like to thank the organizers and Marcello Rivolta, who gave me the possibility to give a talk in this symposium. As you have heard from the previous speakers, many research groups are now attempting to regernate lost inner ear cells. So do we! Universitätsklinik für HNO, Kopf- und Halschirurgie Inselspital, 3010 Bern

Inhalt Einführung Vielfalt der Zellen Definitionen und Typen von Stammzellen Herstellung von Innenohrzelltypen aus Stammzellen Integration von Stammzellen ins hörgeschädigte Innenohr im Tiermodell Stammzellen im Innenohr des Menschen Vorstellung der eigenen Forschungstätigkeit Zusammenfassung The research project that I am going to present to you was started in the Heller Laboratory of the Mass...., and was continued in the Heller Laboratory of the Stanford Medical School after Prof. heller‘s move to Stanford. The largest part of the project, though was then performed in the University Departments of Otorhinolaryngology, HNS in Bern with the aid of the Neurosurgery and Pathology Department.

Der Verlust von Haarzellen im Innenohr führt zu irreversibler Hörschädigung beim Säugetier! As you certainly know, the loss of inner ear hair cells leads to irreversible hearing loss in mammals. On the left you see healthy hair cells and on the right, damaged hair cells. Such a situation occurrs when noise, drugs, diseases, infections and other causes act on the inner ear. Gesunde Haarzellen Geschädigte Haarzellen (Lärm, Gifte, etc.)

To overcome the negative effects of hearing loss, mankind had to invent all kinds of tools. Over time, the tools have become much smaller and smarter and have been mainly based on amplification on sound. The brainstem implant and cochlear implants are working on a different concept, they bypass the function of the inner ear by directly stimulating the auditory nerve, which is the current state of the art therapy for deafness. What will be the future? Gene therapy? Drugs? Stem cells? We don‘t know.

Diese Tiere brauchen keine Hilfsmittel! These guys here are good, birds amphibiens and fish do not need any devices to overcome the negative effects of hearing loss, they can regenerate lost inner ear hair cells from a population of cells witin the inner ear that show features of stem cells . Sie regenerieren Haarzellen von Stammzellen

Definition und Stammzelltypen What are stem cells?

Stammzelltypen Embryonale Stammzellen Werden vom 4–6 Tage alten Embryo gewonnen Somatische oder adulte Stammzellen werden von Geweben des differenzierten Organismus gewonnen There are two main types of stem cells Embryonic stem cells, which are derived from the early embryo and somatic or adult stem cells, which are derived from the mature tissues of an adult animal.

Li et al, 2003

Embryonale Stammzellen Vorteile: Sind die Zellen mit der grössten Potenz Man kann jede Zelle des Organismus herstellen, auch Innenohrhaarzellen! Grosse Vielfalt, grosse Quantität! Man konnte beim Säugetier Haarzellen im Reagenzglas und nach Injektion in ein Hühnerembryo in vivo herstellen Nachteile: Ethisch problematisch, weil der Embryo obligat zerstört wird Anwendung beim Menschen sehr fraglich The research project that I am going to present to you was started in the Heller Laboratory of the Mass...., and was continued in the Heller Laboratory of the Stanford Medical School after Prof. heller‘s move to Stanford. The largest part of the project, though was then performed in the University Departments of Otorhinolaryngology, HNS in Bern with the aid of the Neurosurgery and Pathology Department.

Adulte Stammzellen Werden in den differenzierten Geweben des adulten Organismus gefunden Sind normalerweise verantwortlich für Zellnachschub und Regeneration Werden typischerweise in Geweben mit einem hohen Zellumsatz gefunden Knochenmark Haut Darm I will not talk about ebmryonic stem cells, I will only focus on adult stem cells. These cells are usually responsible for replenishing lost tissue cells, and are usually found in tissues with a high turnover such as in gut, skin and bone marrow.

Innenohr? Hirn Herz Retina Lunge Niere Darm Leber Knochenmark Muskel This slide summarizes the different tissues that have been found to harbour stem cells, there are tissues with high-turnover such as bone marrow, gut or skin and tissues with minimal turnover such as brain, heart and of particular interest to us, the inner ear. Muskel Haut Scott, „Stem Cell Now“, 2006

Li & Heller, Nat Med 2003

Adulte Stammzellen Vorteile: Ethisch viel weniger Problematisch Anwendung beim Menschen eher möglich Die adulte Stammzelle ist schon näher bei der Zielzelle als die embryonale Stammzelle Man kann beim Säugetier Haarzellen im Reagenzglas und nach Injektion in ein Hühnerembryo in vivo herstellen Nachteile: Weniger grosse Quantität möglich Gewinnung unter Umständen schwierig Kleinere Potenz The research project that I am going to present to you was started in the Heller Laboratory of the Mass...., and was continued in the Heller Laboratory of the Stanford Medical School after Prof. heller‘s move to Stanford. The largest part of the project, though was then performed in the University Departments of Otorhinolaryngology, HNS in Bern with the aid of the Neurosurgery and Pathology Department.

Vielfalt der Stammzellen Sowohl embryonale als auch adulte Stammzellen konnten erfolgreich in Haarzellen und Hörnvervenzellen verwandelt werden Es gibt mehrere adulte Stammzelletypen im Innenohr der Maus, die zur Herstellung von Haarzellen verwendet werden können Die Vielfalt der Zellen ist eine gute Voraussetzung für eine allfällige, zukünftige Therapie der Hörminderung The research project that I am going to present to you was started in the Heller Laboratory of the Mass...., and was continued in the Heller Laboratory of the Stanford Medical School after Prof. heller‘s move to Stanford. The largest part of the project, though was then performed in the University Departments of Otorhinolaryngology, HNS in Bern with the aid of the Neurosurgery and Pathology Department.

Integration von Stammzellen ins hörgeschädigte Innenohr im Tiermodell

Transplantation Transplantation von Stammzellen in das Innenohr eines hörgeschädigten Tiers A) Die lärmgeschädigte Hörschnecke B) Der giftgeschädigte Hörnerv

A) Die lärmgeschädigte Hörschnecke Parker et al., Hear Res 2007

Stammzelleninjektion in die hörgeschädigte Cochlea Parker et al., Hear Res 2007

Parker et al., Hear Res 2007

Integration der Stammzellen im Corti-Organ und im Hörnervenganglion Differenzierung in Haarzellen und Hörnervenzellen Parker et al., Hear Res 2007

Stammzellentransplantation zur Haarzellregeneration in der Hörschnecke Erfolgreiche Transplantation Sehr kleine Zahl der Stammzellen überlebt, integriert und differenziert Keine Hinweise oder Angaben zur Verbesserung des Gehörs

B) Der giftgeschädigte Hörnerv Corrales et al., J Neurobiol 2006

Stammzellen zur Regeneration des Hörnerven Erfolgreiche Transplantation Stammzellen überleben, differenzieren und integrieren Keine Angaben zur Verbesserung des Hörvermögens

Integration Ist die grosse Knacknuss auf dem Weg zu einer Stammzelltherapie für Hörschädigung Es reicht nicht, Haarzellen in genügender Zahl im Innenohr zu regenerieren, jede Zelle muss perfekt in das hochkomplexe System des Innenohrs integriert werden, damit ein Hörvermögen erreicht werden kann

Andere stammzellbasierte Ansätze zur Therapie der Hörstörung Eventuell Erfolg versprechender als Stammzell-Transplantation Generierung von Haarzellen in grosser Zahl im Reagenzglas, um Medikamente zu testen Protektive Substanzen gegen Lärm, Gifte etc. Regeneriernde Substanzen Indirekte „Stammzelltherapie“ Hilft, die Anzahl Versuchstiere zu reduzieren

Stammzellen zur Herstellung grosser Quantitäten von Haarzellen im Reagenzglas

Stammzellen im Innenohr des Menschen (?) Vorstellung der eigenen Forschungstätigkeit

Problem Um Stammzellen finden zu können, muss Innenohrgewebe des Menschen untersucht werden Die Entfernung von Innenohrgewebe aus dem Innenohr führt obligat zu einem Hörverlust Innenohrgewebe kann also nur bei destruktiven Ohroperationen gewonnen werden, wo das Gehör geopfert wird (Tumoroperationen) Diese Operationen sind sehr selten

Hypothese Können Innenohren von verstorbenen Spendern zur Gewinnung von Stammzellen genutzt werden?

Pilot Studie bei Mäusen Stammzellen haben bis 10 Tage nach dem Tod im Innenohr überlebt Die Stammzellen konnten bis zu 5 Tagen nach dem Tod Haarzellen und Nervenzellen generieren Senn et al., JARO, 2007

Ziele des laufenden Forschungsprojekts Die Existenz von Stammzellen im menschlichen Innenohr zu beweisen Menschliche Haarzellen und Hörnervenzellen im Reagenzglas herzustellen

Das Forschungsprojekt wurde von der ethischen Kommission bewilligt

Zellkultur Mechanische Vereinzelung Trypsin 0.125%, 3-7 min Trituration 20 - 30 x Einzelzell-Suspension

Vemehrung Differenzierung Sphärenbildung Zelltrennung Zellplatierung Inkubation (37°, 7 Tage) + Wachstumsfaktoren EGF, IGF, FGF, HS Immunocytochemie

Resultate

Felsenbeine Spender (Anzahl) 42 Mittleres Patientenalter 72 Jahre (40 – 86) Mittleres Postmortem Interval 42 Std. (10 – 120)

Erfolgreiche Gewinnung von Sphären aus dem Gleichgewichtsorgan von 18 Patienten

Preliminäre Schlussfolgerung Stammzellen existieren im menschlichen Innenohr Nachweis für das Gleichgewichtsorgan Corti-Organ? Im Reagenzglas können Haarzellen und Hörnervenzellen hergestellt werden aus Stammzellen

Zusammenfassung Vielfalt der Zellen Stammzellen können beim Säugetier zu Haarzellen und Hörnervenzellen differenziert werden Stammzellen existieren wahrscheinlich auch im Innenohr (v.a. Gleichgewichtsorgan) des Menschen und können im Reagenzglas zu Haar- und Nervenzellen differenziert werden Integration ins hörgeschädigte Tier-Innenohr möglich, aber noch keine Verbesserung des Gehörs beobachtet

Schlussfolgerung Es gibt noch keine Stammzelltherapie für Hörgeschädigte, der Weg zu einer solchen ist noch weit Es ist möglich, dass eine Stammzelltherapie für Hörschädigung auch nicht funktionieren könnte Forschung ist zentral und muss intensiviert werden; dazu gründen wir in der Schweiz derzeit eine Stiftung „Swiss Inner Ear Foundation“ (http://innerear.ch) Patienten mit Hörschädigung sollten nicht auf eine Stammzelltherapie warten, wenn sie jetzt eine Therapie brauchen; Cochlea-Implantate stehen heute zur Verfügung

Inner Ear Research Laboratory and Laboratory of Neural Repair, Bern Danksagung The Heller Lab, Stanford Kazuo Oshima Dawn Teo Veronika Starlinger Stefan Volkenstein Stefan Heller Inner Ear Research Laboratory and Laboratory of Neural Repair, Bern Amir Gorguy Mina Angélique Ducray Stefano di Santo Hans-Rudolf Widmer

University Department of Pathology Inselspital Danksagung HNO-Klinik, Inselspital Bern Christoph Stieger Catherine Reid Markus Huth Rudolf Häusler Marco Caversaccio University Department of Pathology Inselspital Alfred Wüthrich Thomas Schaffner

supported by grants Personal grants for young researchers by the SNF 2005 (Boston) and SSMBS 2006 (Stanford) DKF grants-in-aid, Bern DKF research price, Bern MEDEL (from April 1, 2009) Stiftung für Hörgeschädigte Luzern