Schülerkongress GBM-Tagung in Münster 21.09.04 9.00 – 12.30 Uhr

Tagesablauf 1. Einführung 5. Elektrophorese 45 min 2. Gelvorbereitung 30 min 6. Färben der DNA im Agarose- Gel 40 min 3. Schneiden des Plasmids 45 min 7. Auswertung 4. Vorbereitung der Proben für die 8. Vorstellung weiterer Ergebnisse Gelelektrophorese 20 min

Pipettenbedienung

Gelvorbereitung

Schneiden des Plasmids pUCD-lacZ mit BanII

Elektrophoretische Trennung der geschnittenen DNA

Escherichia coli Bewegliches Stäbchenbakterium Natürliches Habit: Intestinaltrakt von Warmblütlern (Darm) Wasserindikator für fäkale Verunreinigungen Haustier der Wissenschaft Verwendeter Stamm in Experimenten: Sicherheitsstamm K12 (JM109) Außerhalb Labor nicht lebensfähig (bestimmte Eigenschaften fehlen) Kein genetisch veränderter Mikroorganismus (natürliches Vorkommen des lacZ-Gens)

Weitere Bakterien Vibrio cholerae Desulfovibrio sp. Leptospira ssp. Salmonella enteriditis

Was ist DNA/DNS? DesoxyriboNucleinSäure Helikaler Doppelstrang 4 Basen Adenin, Thymin Guanin, Cytosin Gene: informationstragende Abschnitte für Proteinbiosynthese 1 Codon aus 3 Nukleotiden entspricht 1 Aminosäure

Proteinbiosynthese: Vom Gen zum Protein

Was sind Restriktionsenyzme? Proteine (Eiweiße) Schneiden DNA an spezifischen Erkennungssequenzen (oft Palindrome)

Was sind Plasmide? Neben chromosomaler DNA oft zirkuläre DNA-Fragmente in Bakterien Sicherheitsplasmide: Keine Weitergabe von Zelle zu Zelle Schematische Karte des Plasmids pUCD-lacZ Ampr: Ampicillinresistenz-Gen Ori: Replikationsursprung

Historie 1865 Mendel 1869 Miescher 1944 Entdeckung der DNA als Trägersubstanz des Erbguts (Avery) 1953 Entdeckung der doppelhelikalen Struktur der DNA (Watson und Crick) 1973 1. rekombinantes Bakterium von Boyer, Cohen und Chang 1977 Gentransfer eines humanen Gens auf ein Bakterium (Insulingen) 1982 Insulin als 1. gentechnisches Produkt auf Markt 1983 1. Gentransfer eines bakteriellen Gens auf eine Pflanze (Tabak) 1985 PCR (Mullis) 1988 Gründung von HUGO (Human Genome Project) 2000 Entschlüssung des humanen Genoms von Craig Venter

Bedeutsamkeit Rekombinante Proteine in therapeutischen und diagnostischen Anwendungsgebieten: - RecHormon (Erythropoietin=blutbildendes Hormon) - Reteplase (tPA=Plasminogen Aktivator ) - Insulin - Glucose Oxidase (Blutzuckermonitoring) - Teststreifen für Urin

Analyse von DNA Agarosegel (molekularer Sieb): kleinere Fragmente wandern schneller als größere Fragmente durch das Agarosesieb. Negative Ladung => Wanderung im Spannungsfeld zur Anode (pos. Pol) Wanderungsgeschwindigkeit linearer doppelsträngiger DNA- Moleküle umgekehrt proportional zum Logarithmus ihrer Größe

Auswertung Vergleich mit bekanntem Bandenmuster DNA- Fragmente (DNA-Molekulargewichtsstandard) BanII schneidet 3x in Plasmid pUCD-lacZ (5669 bp) 3 Fragmente erwartet Berechnung der Größe anhand Plasmidkarte 2504 bp, 2116 bp, 1049 bp

erwartete Ergebnisse 21226 5480+4732+4268 3530 2027+1904 1584 1375 947 831 564

Weitere Experimente von Blue Genes (2. Teil) Klonierung eines DNA-Fragments (= Einschleusung eines Gens in eine Bakterienzelle mit Hilfe eines Plasmids), Weitergabe an Nachkommen, 1 Klon entsteht: 1. Plasmidschneiden, Einfügen von Fragment, Ligation 2. Transformation in E.coli Sicherheitsstamm (nur 1 von 10 000 nimmt Plasmid auf), dessen lacZ-Gen defekt ist 3. Selektion über Antibiotikum Ampicillin (Plasmid enthalten) und über X-Gal (Spaltung zu blauem Farbstoff, Gen erfolgreich eingeschleust)

Klonierung von DNA-Fragmenten

Tipps und Tricks zur Versuchsplanung Lagerungs- und Unterbrechungsmöglichkeiten: Restriktionsansatz nach Inkubation bei 37 °C mehrere Wochen bei – 20 °C 1x Elektrophoresepuffer mehrere Wochen bei RT Nicht verwendetes Gel eingepackt in Folie ca. 1 Woche im Kühlschrank Nicht verwendetes Gel in Elektrophoresekammer mit Puffer überschichtet 2 bis 3 Tage Proben bereits mit Elektrophoresepuffer versetzt Elektrophoresekammer mit Puffer gefüllt 2 bis 3 Tage Färbelösung in Flasche mit Alufolie verdunkelt mehrere Woche bei RT Gelaufenes Gel über Nacht in Wasser, ebenso gefärbtes (Achtung! Entfärbung!)