Komplexierung von Europium(III) und Curium(III) mit organischen Liganden unter biologisch relevanten Bedingungen – erste Hinweise auf ihre Speziation in Biofluiden Anne Heller, Astrid Barkleit, Gert Bernhard GDCh-Fachgruppentagung Nuklearchemie Frankfurt am Main, 01.09.2009 1

Gliederung Motivation und Ziele Zeitaufgelöste Laserfluoreszenzspektroskopie Komplexierung von Eu(III) und Cm(III) mit biologisch relevanten Liganden Speziation von Eu(III) und Cm(III) in menschlichen Urinproben Zusammenfassung Ausblick 2

Schwermetalle/Radionuklide in Biosystemen Motivation Schwermetalle/Radionuklide in Biosystemen verbrauchter Kernbrennstoff ~ 1% Transurane 95% Uran-238 Gd3+ Eu3+ 1% Spaltprodukte 3% Uran-235 Kernbrennstoff: An(III) allgemein  hohe Aktivität Medizin: Gd(III) zugelassen, Eu(III) in Testphase Analogchemie: Ln(III) und An(III) f-Elemente mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften; Ln(III) nicht radioaktiv  Analoga für An(III) Loewen (2004) American Scientist 92 Lukes et al. (2008) Dalton Trans. 23 Freisetzung und Eintrag in Biosysteme und den menschlichen Organismus u. a. durch Störfälle und radiologische Untersuchungen 3

Schwermetalle/Radionuklide in Biosystemen II Motivation Schwermetalle/Radionuklide in Biosystemen II Inhalation Ingestion Wunde Skelett Leber Niere Muskeln Haut Exkretion Absorption Skelett Leber Exkretion Eu1 36 % 25 % 60 – 70 %2 ~ 20 % 5 – 10 %2 Cm3 30 % (HWZ 50 a)4 50 % (HWZ 20 a)4 7 – 10 %5 1 Taylor und Leggett (2003) Rad. Prot. Dos. 105 2 Bingham und Dobrota (1994) BioMetals 7 3 Ansoborlo et al. (2006) Biochimie 88 4 Duffield et al. (1994) Handbook on the Physics and Chemistry of Rare Earths Vol. 18 5 Ménétrier et al. (2008) Appl. Radiat. Isot. 66 Exkretion von Lanthaniden und Actiniden im Menschen v. a. renal Ausscheidungsmedium = Urin Cm: HWZ sind Annahmen der ICRP (International Commission on Radiological Protection) für An allgemein Angaben für die ersten 1 – 7 Tage Ausscheidung abh. von chem. Form  anorg. Salze (Ln/AnCl3) akkumulieren stark, komplexgebundene Ln/An (Albumin, DTPA) werden gut ausgeschieden 4

Menschlicher Urin V = 1.2 – 1.5 l/d, I = 0.1 – 0.2 M, pH 4.0 – 8.0 1 Motivation Menschlicher Urin V = 1.2 – 1.5 l/d, I = 0.1 – 0.2 M, pH 4.0 – 8.0 1 anorganische Urinbestandteile organische Urinbestandteile (Bestimmung per ICP-MS und IC) (Literaturwerte 2) bereits untersuchte Liganden: Carbonat, Chlorid, Nitrat, Sulfat, Phosphate, Oxalsäure, Milchsäure, einige Aminosäuren, z. T. Citrat 3 Harnstoff: 0.6 – 0.8 M (NASA-Report) Citronensäure: 0.5 – 4.8 mM (NASA-Report) Citrat: meist nur vollständig deprotoniertes Cit3- als Ligand betrachtet, kaum spektroskopische Untersuchungen 1 Lehnartz (1952) Chemische Physiologie ² Müller (1977) Klinische Biochemie und Laboratoriumsdiagnostik; Schreier und Pluckthun (1950) Biochem. Zeitschr. 320; Strassner (1980) Laborwerte und ihre klinische Bedeutung ³ Hummel et al. (2002) Radiochim. Acta; Guillaumont et al. (2003) Update on the Chemical Thermodynamics of U, Np, Pu, Am and Tc; Silber und Paquette (2003) Metal ions in biological systems; Mathur et al. (2007) Inorg. Chim. Acta; Portanova et al. (2003) Pure Appl. Chem.; Guillaumont und Bouderie (1971) Bull. Soc. Chim. Fr.; Aly und Latimer (1970) Radiochim. Acta 5

Ziele Untersuchung der Komplexierung von Eu(III) und Cm(III) mit Harnstoff und Citronensäure unter biologisch relevanten Bedingungen Bestimmung der Speziation von Eu(III) und Cm(III) in natürlichen menschlichen Urinproben (in vitro) Berechnung der Speziation von Eu(III) und Cm(III) in menschlichem Urin Vergleich der Komplexierung/Speziation von Eu(III) und Cm(III) Biologisch relevant: Magen  pH 2 Urin  pH 4 – 7 Blut  pH 7.4 6

Fluoreszenz von Eu(III)/Cm(III) Laserfluoreszenzspektroskopie Fluoreszenz von Eu(III)/Cm(III) nach Anregung mit Laserlicht sehr gute Lumineszenz der trivalenten Ionen  Untersuchungen im Spurenkonzentrationsbereich möglich 7F6 5D0 5D2 . 6D7/2 6D5/2 395 nm 8S7/2 7F0 nach Carnall (1968 & 1975) J. Chem. Phys. 49 & 63 5D1 Anregung: 395 nm regen über das fluoreszierende Level hinaus an  strahlungsloser Übergang; Energielücke zwischen Grund und angeregten Leveln zu groß  fluoreszierender Übergang Grundlevel: bei Eu(III) aufgespalten  mehrere Fluoreszenzpeaks; bei Cm(III) entartet  nur ein Fluoreszenzpeak; Energielücke für Eu(III) und Cm(III) etwa gleich groß  ähnliche Bandenlage Eu(III): F0-Übergang in symmetrischen Systemen verboten  Auftreten deutet auf empfindliche Störung der Kugelsymmetrie in der 1. Koord.sphäre hin 7

Laserfluoreszenzmessungen Laserfluoreszenzspektroskopie Laserfluoreszenzmessungen Laser-System: Parameter: λex = 395 nm, λem = 570 – 640 nm ~ 2 mJ Laserenergie, 1 ms Messdauer 10 bzw. 20 µs Delaytime 3∙10-5 M Eu(III) bzw. 3∙10-7 M Cm(III) I = 0.1 M (NaClO4), T = 24 ± 1 °C Stickstoffatmosphäre Box ICCD Kamera Spektrograph Delay Generator OPO System Energie meter Nd:YAG LASER OPO-System: Spiegeloptik + Oszillator TRLFS: Anregung, Messung bei t0 (1 ms lang), Abklingen  erneute Anregung, Messung bei t0 + 10 µs, Abklingen  erneute Anregung, Messung bei t0 + 20 µs … OPO: optisch parametrischer Oszillator (optisch nichtlinearer Kristall in einem optischen Resonator ) 8

Komplexierung mit Harnstoff (U) – Eu(III) Ergebnisse Komplexierung mit Harnstoff (U) – Eu(III) Eu3+ EuU3+ EuUOH2+ log ß -0.12 ± 0.05 -6.86 ± 0.15 λem (in nm) - 589/592 612/616 578 588/592 612/617 Komplex unterscheidet sich v.a. im hypersensitiven Übergang Fluoreszenzmaxima gleichbleibend, Lebensdauer nicht genau bestimmbar (extrem hoher U-Überschuss muss erst einmal hydratisiert werden  Lebensdauererhöhung schon vor Komplexierung) Mischkomplex unsymmetrisch (F0!), Harnstoffmolekül allein stört die Symmetrie kaum Heller et al. (2009) Inorg. Chim. Acta 362 9

Komplexierung mit Harnstoff (U) – Cm(III) Ergebnisse Komplexierung mit Harnstoff (U) – Cm(III) Fluoreszenzmaxima rotverschoben, Lebensdauer nicht genau bestimmbar (extrem hoher U-Überschuss muss erst einmal hydratisiert werden  Lebensdauererhöhung schon vor Komplexierung) Komplexkonstanten geringfügig kleiner als für Eu(III) Gebildete Komplexe und Speziationsdiagramm für beide Metalle gleich Cm3+ CmU3+ CmUOH2+ log ß -0.28 ± 0.12 -7.01 ± 0.15 λem (in nm) 594 599 601 Heller et al. (2009) Inorg. Chim. Acta 362 10

Komplexierung mit Citronensäure (CitH3) – Eu(III) Ergebnisse Komplexierung mit Citronensäure (CitH3) – Eu(III) Eu3+ EuCitH+ EuCit2H2- EuCit log ß 11.15 ± 0.17 15.12 ± 0.78 5.65 ± 0.78 Lebensdauer (in µs) 109 ± 2 151 ± 6 250 ± 10 180 ± 14 - nH2O (± 0.5) 2 5 3 Komplexe unterscheiden sich im hypersensitiven Übergang sowie in F0 Fluoreszenzmaxima gleichbleibend, Lebensdauern entsprechen den ermittelten Stöchiometrien (bei monodentater Bindung jeder Carboxylgruppe) Mischkomplex am symmetrischsten (F0 am kleinsten!), 1:1-Komplexe dagegen stark unsymmetrisch  Unterscheidung der 3 Komplexe 11

Komplexierung mit Citronensäure (CitH3) – Cm(III) Ergebnisse Komplexierung mit Citronensäure (CitH3) – Cm(III) Cm3+ CmCitH22+ CmCitH+ CmCit log ß 13.95 ± 0.10 10.70 ± 0.10 5.57 ± 0.10 Lebensdauer (in µs) 68 ± 1 82 ± 2 96 ± 3 121 ± 9 - nH2O (± 0.5) 1 2 3 Fluoreszenzmaxima rotverschoben, Lebensdauern entsprechen den ermittelten Stöchiometrien (bei monodentater Bindung jeder Carboxylgruppe) Komplexkonstanten geringfügig kleiner als für Eu(III) Gebildete Komplexe und Speziationsdiagramm für beide Metalle unterschiedlich! (Warum??? O.O) 12

Speziation in Urinproben – Eu(III) Ergebnisse Speziation in Urinproben – Eu(III) Spezies Wellenlängen (in nm) Lebensdauer (in µs) Eu3+ 589/592 612/616 109 Urinproben pH < 5.8 579 590/595 614/617 140 – 170 EuCitH+/EuCit 579 590/594 614/616 151/180 Urinproben pH > 5.8 578 588/594 613/617 350 – 830 Elektrolytlösung 579 589/593 613/618 300 – 600 Elektrolytlösung: 7.5 mM (NH4)2SO4 1.3 mM CaCO3 18.5 mM K2HPO4 0.5 mM Mg(NO3)2 60 mM NaCl Elektrolytlösung NASA-Report: NaCl + KCl + K2SO4 + MgSO4 + MgCO3 + KHCO3 + K3PO4 + Ca3(PO4)2 pH-Wert nach Eu(III)-Zugabe (resultiert in Absinken des pH-Wertes der Originalprobe um 0.3 – 0.5 Einheiten, da in Säure gelöst) ICP-MS: Variation der anorganischen Zusammensetzung der Proben 1 – 6 um bis zu 3 Größenordnungen (Probe 2: Fastenkur  Elektrolyte ~ 1000fach niedriger konzentriert als Probe 1 und 3) 13

Speziation in Urinproben – Cm(III) Ergebnisse Speziation in Urinproben – Cm(III) Spezies Wellenlänge (in nm) Lebensdauer (in µs) Cm3+ 594 68 Urinproben pH < 5.8 600 110 – 150 CmCit 121 Urinprobe pH > 5.8 604 210 – 400 Elektrolytlösung laufende Arbeiten pH-Wert nach Cm(III)-Zugabe (resultiert in Absinken des pH-Wertes der Originalprobe um 0.3 – 0.5 Einheiten, da in Säure gelöst) Elektrolytreferenzspektren noch ausstehend 14

Zusammenfassung Rotverschiebung bei Komplexierung von Cm(III) Änderung der Aufspaltung und Intensitätsverhältnisse bei Eu(III) Komplexierung mit Harnstoff vernachlässigbar Citrate sind starke Komplexbildner und relevant für Biofluide Konstanten und Speziation von Eu(III) und Cm(III) ähnlich bei Komplexierung mit Harnstoff, unterschiedlich mit Citronensäure Speziation in Urinproben hauptsächlich durch pH-Wert beeinflusst bei pH > 5.8 anorganische Spezies, bei pH < 5.8 Citronensäure-spezies  Organik muss bei Speziationsrechnungen in Biofluiden beachtet werden bei Eu(III) z. T. F0-Übergang sichtbar  Indizien bezüglich Symmetrie der Komplexe Citronensäure: Ursache der Unterschiede bisher ungeklärt 15

Ausblick Untersuchung der Komplexierung bei 37 °C Körpertemperatur Untersuchungen mit Urinproben von MRT-Patienten (“metabo-lisiertes Ln(III)”) Danksagung Forschungszentrum Dresden-Rossendorf e.V. Hr. Prof. Dr. G. Bernhard Fr. Dr. A. Barkleit Fr. U. Schaefer Fr. C. Eckhardt Hochschule für Technik und Wirtschaft Dresden Hr. Prof. Dr. J.-U. Ackermann Deutsche Forschungsgemeinschaft (BE 2234/10-1) 16

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! 17

Speziationsdiagramme

Erste Ergebnisse Titration 1E-3 M Eu(III) + 1E-3 M CitH3 in 0.1 M NaClO4 Modell aus TRLFS bestätigt (+ erweitert) Konstanten greingfügig höher aber vergleichbar Weitere Messungen bei unterschiedlichem Eu:CA-Verhältnis bereits erfolgt, Auswertung noch ausstehend log ß111 = 11.37 ± 0.11 log ß121 = 16.90 ± 0.15 log ß110 = 7.70 ± 0.10 log ß11-1 = 0.89 ± 0.11 20

Behandlung der Eu(III)-Lumineszenzspektren Rohdaten Flächeninhalt 5D0  7F1 Peakhöhe 592 nm unterschiedliche Behandlung/Normierung hat keinen Einfluss auf das Verhältnis klassischer:hypersensitiver Übergang oder die berechneten Komplexbildungskonstanten zur optischen Veranschaulichung wird Vairante 2 verwendet: Normierung auf die Intensität (Flächeninhalt) des klassischen Überganges (magnetischer Dipol  von Komplexierung theoret. unbeeinflusst) Gesamtfläche 21