Erfahrungen mit UPLC-MS/MS Kopplung in der klinisch-toxikologischen Analytik Michael Böttcher MVZ für Mikrobiologie, Labordiagnostik & Hygiene, Dessau, Germany ®

10 min 1980er Jahre bis heute 3,5 - 5 µm sphärisch, mikroporös psi ( bar) Böden/Meter Ende der 1970er Jahre 10 µm irregulär, mikroporös psi ( bar) Böden/Meter 10 min Anfang der 1970er Jahre 40 µm pellikulär, nicht-porös psi (7-40 bar) Böden/Meter 10 min Warum UPLC? Zunahme der chromatographischen Auflösung

H = HETP (Height Equivalent to Theoretical Plate) H = “Bodenhöhe” [µm] Die zur Erreichung eines Gleichgewichtes zw. mobiler und stationärer Phase benötigte Trennstrecke. H möglichst klein, so dass mehr "Böden in die Säule passen". Die chromatographische Auflösung Rs ist proportional zur Quadratwurzel von N = Bodenzahl (+Selektivität+Retentivität) N= Bodenzahl (aus der Destillationstheorie) 5 Böden 10 Böden (H größer) (H kleiner) "dicker" "dünner" L : Säulenlänge Plate HETP

A-Term B-Term C-Term u H = a(dp) + b + c(dp) 2 u A-Term (Eddy Diffusion) – Streudiffusion, abhängig von der Partikelgröße – unabhängig von der Geschwindigkeit B-Term (Molekulare Diffusion, axial) – umgekehrt proportional zur Geschwindigkeit C-Term (Massentransferkinetik) – proportional zur Geschwindigkeit – proportional zum Quadrat der Partikelgröße – beschreibt Wechselwirkung der Analyten an stationärer Phase Van Deemter Gleichung Lineare Geschwindigkeit [mm/sec]

A Term (Partikelgröße und “Packweise”) Height Equivalent to Theoretical Plate Lineare Geschwindigkeit [mm/sec] u HETP minimal => Optimale Bodenzahl HETP Böden H C Term (Massentransfer) B-Term (Axial Diffusion) A-Term B-Term C-Term H = a(dp) + b + c(dp) 2 u u C-Term B-Term Van Deemter Kurve

Voraussetzungen für UPLC mit MS-Kopplung -- geringe Totvolumina -- Pumpe für hohe Drücke -- schneller Detektor für schnelle Peaks u. Multi-MRM: - kurze Dwell-Time ohne Intensitätseinbußen - kurzer InterChannel delay aber kein „Cross-Talk“ - kurzer InterScan delay

A B CD Elimination of EtG and EtS

EtG and EtS with LC/MS-MS

Ion suppression experiment: EtG infusion, urine injected EtSEtG

EtSEtG Ion suppression experiment: EtG infusion, serum injected

UPLC-MS/MS serum calibration EtG

UPLC-MS/MS serum calibration EtS

Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!