Expressionssystem Escherichia coli Rekombinantes Protein http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/Novagen_petsystem.pdf Escherichia coli Figure 3-10 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008) Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)

Escherichia coli Prokaryot Gramnegatives Enterobakterium Einfache Klonierung Kurze Generationszeit Einfaches Screening Figure 1-18a Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)

Escherichia coli BL21[DE3] Fehlende Proteasen Induzierbarkeit (IPTG) Kompatibel mit allen pET-Vektoren Figure 1-18a Molecular Biology of the Cell, Fifth Edition (© Garland Science 2008)

Expressionsvektor pCDFDuet-1 MCS: Multiple Cloning Site His-tag coding sequnece T7 Promotor Ori: Bakterieller Replikationsursprung Sm: Antibiotika-Selektionsmarker lacI: lac-Repressor pCDFDuet-1 http://www.merckmillipore.com/DE/en/product/pCDFDuet%E2%84%A2-1-DNA,EMD_BIO-71340#documentation

Induzierbarkeit IPTG E. coli BL21(DE3) T7 RNA-Polymerase unter lac-Promotor T. Dingermann: Gentechnik, Biotechnik, 2011; WVG Stuttgart

Induktion durch IPTG http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/Novagen_petsystem.pdf

Klonierungsstrategie pCDFDuet-1 http://www.merckmillipore.com/DE/en/product/pCDFDuet%E2%84%A2-1-DNA,EMD_BIO-71340#documentation

Klonierungsstrategie Gene of interest His Schnittstellen? Reading frame? GOI codiert für SGD (STR-Glukosidase) His-Tag zur affinitätschromatographischen Aufreinigung

Reinigung von Proteinen IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography) Natürliche Tendenz von Histidin mit zweiwertigen Ionen zu komplexieren Aufreinigung von Proteinen nach: Löslichkeit Größe Ladung Bindeaffinität Histidin: Figure 8-13 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Affinitätschromatographie Recombinant protein His tag Ni-IDA 2. 3. 1. 1. 3. 2. http://www.mn-net.com/Portals/8/attachments/Redakteure_Bio/Protocols/Protino/UM_ProtinoNi_TED.pdf http://www.mn-net.com/Portals/8/attachments/Redakteure_Bio/Protocols/Protino/UM_ProtinoNi-IDA.pdf

Affinitätschromatographie Recombinant protein Imidazol Imidazole http://de.wikipedia.org/wiki/Imidazol Ni-IDA

Monoterpenindolalkaloide Ma X et al. Plant Cell 2006;18:907-920 (modified)

Strictosidin Glucosidase Tryptophan Decarboxylase Strictosidine Synthase Strictosidine Glucosidase Vinblastine and Vincristine

Spindelgifte Anticancer drugs:  Medically important substances  Isolated from Catharanthus roseus Vinca alkaloids: Vinblastine and Vincristine Anticancer drugs: → Spindle Poisons !

Zusammenfassung Proteinexpression in Escherichia coli: Einfache und schnelle Klonierung und Transformation Vielzahl an Plasmiden erhältlich (mit Tags und Fusionsgenen) Induzierbare Expression großer Mengen rekombinanter Proteine (T7 Promotor) Einfache Extraktion der Proteine (nativ oder denaturierend) Zur Produktion rekombinanter Arzneistoffe oder zum rekombinanten Nachbilden pflanzlicher sekundärer Stoffwechselwege

Proteinexpression Klonierung (Restriktion, Ligation) Transformation in E. coli Proteinexpression in E. coli Proteinextraktion Affinitätschromatographie

Transformation Chemische Transformation chemisch kompetente Zellen Behandlung mit CaCl2 Aufnahme von DNA-Fragmenten in die Zelle Einfache und schnelle Durchführung (kit-basiert) Hohe Transformationseffizienz