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Mini-Review Enzymatic technologies for remediation of hydrophobic organic pollutants in soil G. Eibes, A. Arca-Ramos, G. Feijoo, J. M. Lema and M.T. Moreira.

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1 Mini-Review Enzymatic technologies for remediation of hydrophobic organic pollutants in soil G. Eibes, A. Arca-Ramos, G. Feijoo, J. M. Lema and M.T. Moreira Julia Majer

2 In Europa (27 Länder) sind ca Bodenstellen als kontaminiert identifiziert 15 % davon wurden bis jetzt erst saniert Verschlechterung der Bodenqualität (in EU) verursacht pro Jahr Kosten von bis zu 38 Milliarden Euro (Liedekerke et al., 2014) Abfallbeseitigung (Städte, Industrie) Einlagerungen (Ölspeicher, veraltete Chemikalienlager) Andere (Landwirt- schaft) Militär (Kriegsgebiete, militärische Lager) Verschüttungen beim Transport am Land (Öl) Industrielle/ gewerbliche Aktivitäten (Kraftwerke, Bergbau) Hauptgründe lokaler Kontaminationen (%) Nukleare Betriebe (0.1%)

3 64 % der Bodenverschmutzung in Europa sind organische Kontaminationen niedrige Wasserlöslichkeit & Resistenz gegen biologische, chemische, photolytische Zersetzung Neben gesundheitlichen Schäden, Einfluss auf biogeochemischen Zyklus & Ökosystem Hauptklasse Verwendung als Getriebeöl (Industrie, Automobilen) Chlorhaltige Kohlenwasserstoffe Verwendung zur Herstellung von Lösungsmittel, Pestiziden, Schutzmittel & Farbstoffe Karzinogen polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe Verbrennung fossiler Brennstoffe, Abfallentsorgung, Verschüttungen (Petroleum oder Kohle) Besitzen toxische, mutagene, teratogene & karzinogene Eigenschaften Aromatischen Kohlenwasserstoffe Benzol, Toluol, Ethylbenzol & Xylol Weichmacher, Pestiziden & Sprengstoff Karzinogen & neurotoxisch (Eibes et al., 2015)

4 Biologische Zersetzung der Schadstoffe ist von folgenden Eigenschaften abhängig: 1.) Schadstoffe: chemische Struktur, Polarität, Hydrophobizität 2.) Umwelt: pH, Temperatur, Redoxbedingungen 3.) Boden: Aggregation, Schlickdicke, Tonbetten, Anteil gelöste org. Stoffe → langsamer Prozess der Regenerierung → Wiederherstellung und Dekontaminierung haben Priorität Ursprüngliche Methode Abtragung des verseuchten Boden und Deponierung, Einfüllen von sauberem Boden → „dick and dump“ Entfernen der org. Kontaminationen durch Waschen, Lösungsmittel Extraktion, Oxidation oder Verbrennung (bzw. Kombinationen) Nachteile: technologische Komplexität, hoher Aufwand, hohe Kosten ( Mio/ha), mögliche sekundäre Kontaminationen

5 Alternative Methoden „Bioremediation“ mit biologischen Agentien → Einsatz von Bakterien, Pilzen und Pflanzen (Whole cell system) Optimale Bedingungen zur Bodensanierung: Schutz vor exogenen Mikroorganismen & Flora, Sauerstoff- & Nährstoffversorgung, Resistenz gegen weitere Schadstoffe → Problematische Anwendung → Enzymbasierende Technologien Anforderungen: hohe Enzymstabilität, erschwingliches Produktionssystem, unabhängig von teuren Cofaktoren/-enzymen, hohe Substrataffinität Vorteile: höhere Spezifizität, leichtere Handhabung & Lagerung, mobiler(< Größe), Toleranz gegenüber unterschiedlichen Schadstoffkonzentrationen Breiteres Spektrum an Umweltbedingungen (pH, Temperatur, Redoxpotential) und biologisch abbaubare Proteine Mittels rekombinanter DNA Technologien können stabilere & hoch aktive Enzyme im großen Maßstab und zu niedrigen Kosten hergestellt werden

6 In situ Behandlung → „am Ort“ Vorteile:Minimale Störung der Umwelt Keine Transport- & Ausgrabungskosten Nachteile: langsame Enzymkinetik unkontrollierbare Parameter (pH-Wert, Temperatur) Weitere Einflüsse: Schadstoffe (Chemie, Toxizität, Biodegradation, Konzentration, Dispersion, Quelle, Löslichkeit, flüchtig,…) Boden (chemisch, biologisch, physikalisch) Anwendung bei sehr ernst zu nehmenden Kontaminationen, sofortiger Eingriff notwendig Ausgrabung kontaminierten Bodens → Behandlung außerhalb Methoden: Landfarming. Kompostierung & Schlammbioreaktoren Ex situ Behandlung → „außerhalb des Ortes“

7 Free enzymes Multienzym Komplex EZT-MZC ™ US Patent von Stolzenberg und Dunner (1999) produziert von Pseudomonas sp. Entfernt v.a. PAHs aus dem Boden Boden eines Gaswerks, Behandlung als Mikrokosmen (4,5 kg Erde) Nach ca. 2 Wochen: 20% Hauptschadstoff reduziert Nachteil: Reduktion aller einheimischen Populationen erforderlich Thule Air Base in Grönland (Vinson and Garret 2000) 1997: Transportunfall, Gallone des JP-8 Kraftstoffes verseuchen Boden & Fluss Multienzym Komplex & Bakterienkulturen (Patent: Enzyme Technologies Inc. of Portland) Umwandlung von Kraftstoffe in einfache Fettsäuren Komplex beststeht aus Extrakten von TPH (Total Petroleum Hydrocarbon) -abbauenden Bakterienkulturen (Kraftstoffverschüttungen aus Serbien) 90 Tage Sanierung → weniger als 5% der Anfangskonzentration Kosten large-scale: $ pro Kubikyard In situ

8 Immobilizied enzymes In situ 2.) Arthrobacter sp. HB-5 Laccase (Ma et al. 2011) Immobilisierung auf Natriumalginat Breiteres pH-Spektrum → Nach 144 h 90% Atrazin (Herbizid) entfernt 1.) Mangan Peroxidase adsorbiert auf Nanoclay (= Schichtsilikate) (Acevedo et al. 2010) Mineralien im Boden als natürliche Stützen für Enzymimmobilisierung Erhöhte Stabilität bei hoher Temperatur bzw. pH-Wert und längerer Lagerungszeit Keine negativen Effekte bei PAH Sanierung in wässrigen Systemen → Nach 24 h 90% PAHs entfernt (http://www.nanocor.com/img/montSchematic.bmp)

9 Slurry bioreactors Vermischen des kontaminierten Boden mit mikrobieller Kultur in einem Reaktor Vorteil: Kontrolle kritischer Parameter Nachteil: Hohe Kosten pro Anwendung Ex situ 1.) Rotierender Reaktor zur Behandlung von mit endokrinen Disruptoren (Umwelthormone) verseuchten Böden (Tanaka et al. 2001) Mobiler Reaktor, ähnlich Betonmischer mit 10 rpm Laccase aus Trametes sp. → Nach 8 h Entfernung von ca. 90% an Octylphenol, Nonylphenol, Bisphenol A & Ethinylestradiol → Nach 24 h Entfernung der restlichen Östrogene zu 85-99% (Tanaka et al., 2001)

10 Bioreactors containing organic solvents → Extraktion von organische Verbindungen aus dem Boden mittels Lösemittel Stoff, der Gase, Flüssigkeiten oder Feststoffe lösen kann, ohne damit zu reagieren „Gleiches löst Gleiches“ 1.Sortieren des kontaminierten Materials 2.Aufbereitung des Bodens mit Lösemittel in Extraktionskammer 3.Seperator: Trennung des verschmutzen Lösemittel vom Boden 4.Nachbehandlung: Entfernung restlicher Lösungsmittel (Vakuumextraktion) 5.Separat: Trennung Lösemittel von Schadstoffen Ex situ → Kein kompletter Sanierungsprozess, kein Abbau der Schadstoffe → Off-site Lagerung (Verbrennung, Deponierung)

11 Anreicherung des kontaminierten wässrigen Extrakts Kombination aus Lösemittel Extraktion und enzymatischer Reaktion Erlaubt Wiederverwendung des Lösemittels & Erschaffen von biologisch abbaubaren Produkten Behandlung der kontaminierten Lösemittel Ex situ I. Single-phase bioreactor Einphasiges Wasser-Lösemittel Gemische Häufig verwendete mischbare Lösemittel: Ethanol, Methanol, Aceton Bsp.: Sanierung von mit Anthracen verseuchten Wasserabfällen (Karim and Husain 2010) „Bitter gourd Peroxidase“ (Momordica charantia) immobilisiert auf Alginat-Beads (3 µm) Einphasige Lösemittelgemisch besteht aus Aceton (17,5%): Dimethylformamid (17,5%): H 2 O Kontinuierlicher „Spiral bed reactor“ (20 mL/h) Nach 5 Tagen Entfernung von 100% Anthracen (Karim, 2010)

12 II. Two-phase partitioning bioreactor Ex situ 2 Phasen: 1.Organisch Phase → nicht mischbar, Lösemittel 2.wässriger Phase → enthält Enzyme Bsp.: Abbau von Anthracen mittels Laccase Silikonöl als org. Phase mit hohen Konzentrationen an extrahierten Schadstoff Triton X-100 als Co-Solvens (mit Konzentrationen oberhalb der kritischen Micellenbildungskonzentration) → überführt Anthracen in wässrige Phase Mehrere Zyklen möglich → Kostengünstiger jedoch Abnahme der Enzymaktivität Nach 24 h Entfernung von 100% Anthracen Eibes G, López C, Moreira MT, Feijoo G, Lema JM (2007a) Strategies for the design and operation of enzymatic reactors for the degradation of highly and poorly soluble recalcitrant compounds. Biocatal Biotransform 25(2–4):260–268 (Arca-Ramos et al. 2014)

13 Zusammenfassung Verschiedene Enzyme zeigen starke katalytische Aktivitäten bei der Sanierung von kontaminierten Böden Jedoch ist ihre large-scale Anwendung, v.a. aus finanziellen Gründen immer noch limitiert Industrielle Produktion oxidativer Enzyme ist essentiell für reale Anwendung der biologischen Sanierung von kontaminierten Böden Verbesserung der enzymatischen Stabilität mittels Protein Engineering sowie Optimierung von physikochemischen Eigenschaften

14 Liedekerke, M. v., G. Prokop, S. Rabl-Berger, M. Kibblewhite and G. Louwagie (2014). Progress in the management of contaminated sites in Europe. JRC Reference Reports, Joint Research Centre of European Comission: 68 M.D. Cameron, A.D. Aust (1999). Degradation of chemicals by reactive radicals produced by cellobiose dehydrogenase from Phanerochaete chrysosporium. Arch. Biochem. Biophys., 376, pp. 115–121 Cameron MD, Timofeevski S, Aust SD (2000) Enzymology of Phanerochaete chrysosporium with respect to the degradation of recalcitrant compounds and xenobiotics. Appl Microbiol Biotechnol 54(6):751–758 Syed K, Porollo A, Lam YW, Grimmett PE, Yadav JS (2013) CYP63A2, a catalytically versatile fungal P450 monooxygenase capable of oxidizing higher-molecular-weight polycyclic aromatic hydrocarbons, alkylphenols, and alkanes. Appl Environ Microbiol 79(8):2692–2702 Kawahigashi H, Hirose S, Ohkawa H, Ohkawa Y (2007) Herbicide resistance of transgenic rice plants expressing human CYP1A1. Biotechnol Adv 25(1):75–84 Vinson R, Garret K (2000) Enzyme-enhanced bioremediation at Thule Air Base, Greenland. Fed Facilities Environ J 10(4):39–49 Acevedo F, Pizzul L, Castillo MD, González ME, Cea M, Gianfreda L, Diez MC (2010) Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by free and nanoclay-immobilized manganese peroxidase from Anthracophyllum discolor. Chemosphere 80(3):271–278 Ma T, Zhu L, Wang J, Wang J, Xie H, Su J, Zhang Q, Shao B (2011) Enhancement of atrazine degradation by crude and immobilized enzymes in two agricultural soils. Environ Earth Sci 64(3):861–867 Karim Z, Husain Q (2010) Removal of anthracene from model wastewater by immobilized peroxidase from Momordica charantia in batch process as well as in a continuous spiral-bed reactor. J Mol Catal B Enzym 66(3–4):302–310 Huang, Q. (2013). Enzyme composition and methods to transform perfluoroalkyl compounds in soil and/or groundwater. US, Google Patents Tanaka T, Tonosaki T, Nose M, Tomidokoro N, Kadomura N, Fujii T, Taniguchi M (2001) Treatment of model soils contaminated with phenolic endocrine-disrupting chemicals with laccase from Trametes sp. in a rotating reactor. J Biosci Bioeng 92(4):312–316 Literaturquellen


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