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Die Messenger RNA (mRNA) erhält nach der Transkription sowohl eine 5-Kappe wie einen 3-Polyadenylat-Schwanz 5-Kappe 3-Poly(A)-Schwanz mRNA (post-transkriptionale.

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1 Die Messenger RNA (mRNA) erhält nach der Transkription sowohl eine 5-Kappe wie einen 3-Polyadenylat-Schwanz 5-Kappe 3-Poly(A)-Schwanz mRNA (post-transkriptionale Modifizierung)

2 3 Polyadenylat-Schwanz mRNA Spaltsignal mRNA n = Nukleotide der Polyadenylatschwanz wird erst zum Ende der Transkription von einem Enzym ( PolyA-Polymerase ) an das gespaltende 3-Ende angehängt ( Transkriptions-Termination ) Spaltung durch Endonuclease Der polyA-Schwanz 1. erhöht Stabilität der mRNA 2. wichtig beim Export der mRNA ins Zytoplasma 3 UTR ORF

3 Die Polyadenylierung der mRNA DNA RNA-Polymerase polyA-Polymerase mRNA

4 Der Poly(A)-Schwanz erlaubt die einfache und schnelle biochemische Reinigung von poly(A) + RNA durch Affinitätschromatographie Säule mit poly(U) gebunden an kleine Sepharose-Kügelchen reine poly(A) + RNA >Northern, cDNA-Synthese, RT-PCR

5 Die Bildung der 5-Kappe an der mRNA erfolgt nur bei Eukaryonten ungewöhnliches 5-5Triphosphat der 5-Kappe wird noch während der Transkription von den entsprechenden Enzymen (capping enzymes) an das 5-Ende angehängt die 5-Kappe erhöht die Stabilität der mRNA - Kontrolle der Gen- Expression die 5-Kappe ist wichtig beim Export der mRNA in das Zytoplasma und bei der anschließenden Translation (Anlocken von Initiationsfaktoren der Translation) vom Gen kodiert später angehängt

6 RNA-Turnover

7 De-Adenylierung und Entfernung der 5-Kappe sind Signale zum Abbau der mRNA 5-Kappe decapping enzyme

8 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

9 ……eine weitere post-transkriptionale Veränderung das Spleißen der Prä-mRNA

10 Die Entdeckung des Spleiß-Phänomens bis 1977 hatte man die Vorstellung, daß die DNA-Sequenz eines Gens co-linear mit der Aminosäure-Sequenz ist als man aber die reife mRNA von bestimmten Genen isolierte (polyU-Affinitätschromato- graphie) und mit der entsprechenden DNA-Matritze hybridisierte und die DNA::RNA- Hybride im Elektronenmikroskop sichtbar machte, gab es eine unerwartete Entdeckung >>>> die gereinigte mRNA war viel kürzer als die DNA-Matritze Intron Exon TACGGATCGTA ACAGTAGGCTATAAC AUGCCUAGCAU-UGUCAUCCGAUAUUG NNNNCTANNNNCTA NNNNCTANNNNCTA NNN N

11 Die Struktur des Hühner-Ovalbumin-Gens DNA-Matritze ElektronenmikroskopieZeichnung E mRNA die Schleifen A-G sind die 7 Introne, die im primären Transkript noch vorhanden sind, später aber bei der Reifung der mRNA herausgeschnitten werden. das Entfernen der Introne wird als Spleißen ( splicing ) bezeichnet

12

13 AUG Stop Exon Intron 8000 Nts Intronsequenzen werden durch Spleißen entfernt reife mRNA Protein (Ovalbumin) Translation Prä-mRNA

14 Chromosom mit 1.5 x 10 8 Nucleotid-Basenpaaren - ca Gene 0.5% des Chromosoms enthält Gene >>> 15 Gene ein Gen mit 10 5 Nucleotid-Basenpaaren Promoter Transkription IntronExon Spleißen mRNA Prä-mRNA

15 Transkription Bildung der 5-Kappe ExonIntron Spleißosome Intron Spleißen Polyadenylierung prä-mRNA mRNA

16 > das Spleißen ist ein äußerst komplizierter Vorgang - ca. 300 Komponenten beteiligt > der Spleiß-Enyzm-Komplex wird Spliceosome genannt > die meisten Gene höherer Eukaryonten haben Introne (bis zu 40 pro Gen) > die Exone sind weniger als 1000 BP lang, in der Regel Nukleotide (entspricht Aminosäuren) > die Größe der Introne schwankt von Nukleotide > die DNA, die den Intronen entspricht, ist daher viel mehr als die DNA, die für die Exone kodiert (Gen > BP; mRNA > BP)

17 die Entfernung des Introns aus der Prä-mRNA muß äußerst präzise ablaufen, damit die reife mRNA korrekt für das entsprechende Protein kodiert die Präzision muß auf ein Nukleotid genau sein (molekulares Skalpell) prä-mRNA mRNA Korrekt gespleißt mRNA falsch gespleißt fehlerhaftes Spleißen > frameshift Mutation >andere Aminosäuresequenz korrektes Spleißen

18 Wie schneidet das Spliceosom derart korrekt die Introne aus der Prä-mRNA? man findet beim Vergleich der Exon/Intron-Übergänge bzw. Intron/Exon-Übergänge Consensus-Sequenzen A G G U A A G U…………………..C A G GConsensus-Sequenz 5-Spleißstelle3-Spleißstelle

19 die Basensequenz eines Introns beginnt GU und endet mit AG Introne haben noch eine wichtige interne Stelle, die stets ca Nukleotide stromaufwärts von der 3 AG-Spleißstelle liegt und Verzweigungsstelle (branch site) genannt wird. In Hefe lautet die Verzweigungsstelle nahezu immer UACUAAC (TACTAAC-Box) Bereiche zwischen der 5 und 3 Spleißstelle und der Verzweigungsstelle sind relativ unwichtig für das Spleißen des Introns durch Mutationen in jeder dieser drei wichtigen Regionen kann es zur Hemmung des Spleißens bzw. zu einem veränderten Spleißen kommen falsches Spleißen verursacht auch Krankheiten, z. B. einige Formen von Thalassämien = erbliche Blutkrankheiten (Anämien) >>> defekte Hämoglobinsynthese Allgemeine Regeln bei den Spleiß-Consensus-Bereichen 5-Spleißstelle3-Spleißstelle branch site

20 (1) Normale Globin prä-mRNA Exon 2Exon 3Exon 1Intron 2Intron 1 (2) Mutierte Globin prä-mRNA Exon 2Intron 2 Punktmutation Exon 1 verlängertes Exon Intron 1Exon 3 Exon 2Exon 3Exon 1 mRNA Protein -Thalassämien 128 kein Häm -----CCTAT T GGTCTATTTTCCACCCTT AG G CTG CCTAT A G G TCTATTTTCCACCCT TAG GCTG--- Mutation Exon 2 Exon 3 normale Spleißstelle Stop Codon Exon 2 neue Spleißstelle Exon 3 (2) (1) Stop Exon 2Exon 1 mRNA Exon 3

21 am Spleißvorgang sind viele Komponenten beteiligt Spleiß-Enzyme 5-Kappe 3 U1 U2 U5 U6 U4 U-snRNA (Uridin-rich, small nuclear RNA) U-snRNAs Proteine + U-snRNPs (Snurps)

22 Exon 2 Intron konserviertes A in TACTAAC-Sequenz biochemisch handelt es sich beim Spleißen um die Spaltung und Neubildung von Phosphodiester-Bindungen = Transesterifizierungs-Reaktionen (ohne Energie) das Spleißen beginnt mit einem nukleophilen Angriff der 2-OH-Gruppe des kon- servierten Adenins innerhalb des Introns auf die 3-5 Phosphodiester-Bindung am 5 Exon/Intron-Übergang Exon 2 es entsteht das Lasso-Intermediat (lariat)

23 Ex1Ex2 5 3 Verzweigung U1 und U2 die 5-Spleiß stelle und die Verzweigungsstelle U-snRNPs (Snurps) die verschiedenen U-snRNPs reagieren nacheinander mit den verschiedenen Spleiß- stellen, bis sich ein funktions- fähiges Spliceosom ausgebildet hat U4, U5 und U6 lagern sich zusammen bei der Bindung von U4, U5 und U6 kommt es zum 5-Spleißen U6 hält Exon 1 im Spliceosom (Lasso-Bildung lariat ) U2 und U4 verlassen das Spliceosom U1 verläßt das Spliceosom U5 und U6 verlassen das Spliceosom

24 5 3 U1 Wie können die Snurps am Spleißvorgang teilnehmen? die snRNA-Moleküle haben an den Stellen, an denen keine Proteine gebunden sind, einzel- strängige RNA-Bereiche, die komplimentär zu den Consensus-Bereichen im Intron sind U1 U2 Exon 1 Exon 2 Intron Verzweigungsstelle 5-Spleißstelle 3-Spleißstelle U2 bindet an die Verzweigungsstelle U1 bindet an die 5-Spleißstelle U5 bindet an die 3-Spleißstelle GUCCAUUCA hemmendes Oligonukleotid U1

25 Hemmung des Spleißvorgangs durch Auto-Immunantikörper Hemmung des in vitro Spleißens durch Auto-Immunantikörper ( Patienten mit systemischem Lupus erythematodes) Autoimmun-Krankheit: Antikörper gegen zelleigene Proteine; z. B. gegen die Sm-Proteine der U-snRNPs Gelenke und die meisten Organsysteme stark beeinträchtigt >>>> Schlüsselrolle der U-snRNPs beim Spleißen entdeckt mit Hilfe dieser AK

26 Der Mechanismus des Prä-mRNA-Spleißens

27 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

28 (E)

29 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung

30 9 kb = BP/3 = AS x 100 Da = Da

31 Fragen aus der schriftlichen Physikumsprüfung 52 Ein Gen enthält zwei Exons: Die Anzahl der Basen in der codierenden Sequenz beträgt 300 im Exon 1 und 600 im Exon 2. Die mittlere relative Molekülmasse der von diesen Exons codierten Aminosäuren ist 110/Aminosäure. Welche relative Molekülmasse wird für das codierte Protein mit einem Fehler von plus/minus 1000 bestimmt? (A)3 000 (B) (C) (D) (E)

32 Welche physiologische Bedeutung hat das Spleißen? Warum gibt es Introne in der prä-mRNA, die beim Reifung zur mRNA entfernt und abgebaut werden?

33 warum Gene Introne haben ist in vielen Fällen noch unklar (Introne sind letztendlich Abfall!) Welche physiologische Bedeutung hat das Spleißen? Man kennt physiologisch-relevante Spleißvarianten: (1) alternatives Spleißen: erlaubt, aus einem einzigen Gen mehrere Genprodukte zu erhalten (Dogma 1 Gen > 1 Protein) (2) Trans-Spleißen : 5-Exon eines Gens wird an das 3-Exon eines anderen Gens gehängt >> dies ermöglicht der Zelle neue Genprodukte (Proteine) mit neuer Funktion zu schaffen Alternatives Spleißen (z. B. 3-alternativ) Beispiele für alternatives Spleißen findet man bei den Immunglobulinen, Myosine, Hormonen etc. Exon 1Exon 2 Alt.Exon Exon 1 Exon 2 Exon 1 Exon 2 Alt.Exon Intron Alt.ExonIntron Alt.Exon 5 3 3

34 Der Lebenszyklus einer mRNA


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