AGTK Wehrend Vorlesung: Andrologie und instrumentelle Samenübertragung Wintersemester 2006/7, 7. Fachsemester - Geschlechtsentwicklung, Neurohormonale.

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1 AGTK Wehrend Vorlesung: Andrologie und instrumentelle Samenübertragung Wintersemester 2006/7, 7. Fachsemester - Geschlechtsentwicklung, Neurohormonale Regulation der männlichen Fortpflanzung, Geschlechtsreife, Zuchtreife, Spermatogenese, Spermienmorphologie, Spermienreifung

2 AGTK Wehrend Tierärztliche Motivation - Diagnostik von Fortpflanzungsstörungen - Therapie von Fortpflanzungsstörungen - Manipulation der Fortpflanzungsfunktionen (Biotechnologie der Fortpflanzung, zootechnische Maßnahmen)

3 AGTK Wehrend Geschlechtsentwicklung Die Geschlechtsentwicklung erfolgt stufenweise: 1.Genetisches Geschlecht 2.Gonadales Geschlecht 3.Phänotypisches Geschlecht 4.Psychisches Geschlecht (Was bin ich?) ?

4 AGTK Wehrend 1.Genetisches Geschlecht: Zum Zeitpunkt der Befruchtung durch das haploide Spermium festgelegt indifferente Geschlechtsanlage – basic female auf dem Y-Chromosom ist der Testis-determinierender Faktor (TDF) kodiert, der die Entwicklung in Richtung männlich festlegt. Aus: Drews, 1993

5 AGTK Wehrend SRY = Gen, welches den Testis-determinierenden Faktor (TDF) kodiert. SRY = Sex determining region of the Y chromosome XX-Rüden: Durch Translokation gelangt SRY auf das X-Chromosom Aus: Passarge, 1994

6 AGTK Wehrend 2.gonadales Geschlecht: Differenzierung von Sertoli- und Leydigzellen, Ausbildung des fetalen Hodens Sertolizelle: produziert Anti-Müllerian-Hormon – Rückbildung des Müllerschen Gang Leydigzelle: produziert Testosteron – Wandlung des Wolfschen Ganges zu Nebenhoden, Entwicklung der Geschlechts- organe Zeitpunkt: bei großen Haussäugetieren ab der 3. Woche Aus: Drews, 1993

7 AGTK Wehrend 3.Phänotypisches Geschlecht: Ausbildung der Geschlechtsorgane - direkt und indirekt über Testosteron - durch Gabe von Testosteron während der Gravidität können genetisch weibliche Feten männlich geprägt werden Virilisierung oder Maskulinisierung - Beispiel: Freemartinismus oder Zwickenbildung Aus: Drews, 1993

8 AGTK Wehrend Frequenz von Zwillingen beim Rind 0,3 – 9 % - 95 % dizygot – davon 45 % heterosexuell - bei 95 % der heterosexuellen Zwillingen kommt es zur Anastomosenbildung der Chorionkreisläufe – dadurch Austausch von - Zellen (natürliche Chimärenbildung) - Anti-Müller-Hormon - Androgenen Chimäre: Körperzellen aus mehr als einer Zygote

9 AGTK Wehrend Aus: Grunert, Bertchold: Fertilitätsstörungen beim Rind

10 AGTK Wehrend Wirkung des Testosterons im männlichen Organismus Viele Wirkungen des Testosterons erfolgen nicht direkt, sondern erst nach Umwandlung zu Östrogenen (psychische Geschlechts- determination, Haarwuchs) oder zu Dihydrotestosteron. Die Wirkung der Steroidhormone wird über Rezeptoren vermittelt. Aus: Hoffmann, 2003 Neuroendokrine Regulation der Fortpflanzung: - pränatale maskulinisierende Östradiolwirkung durch intraneuronale Aromatisierung fetaler Androgene -stellt den Pulsgenerator im Hypothalamus auf männlich ein weiblich: zyklischer Pulsgenerator männlich: tonisch/klonischer Pulsgenerator

11 AGTK Wehrend Fehlende Testosteronwirkung (Feminisierung) Keine oder mangelhafte Testosteronsynthese Keine oder mangelhafte Testosteron- metabolisierung Rezeptordefekt Gene liegen auf dem X- Chromosom Folge: Männlicher Genotyp mit weiblichen Phänotyp

12 AGTK Wehrend Feminisierung auch durch Östrogenwirkung beim adulten Tier möglich Beispiel: Feminisierungssyndrom des Rüden

13 AGTK Wehrend 4.Psychisches Geschlecht: Determination des Gehirns - Das männliche Verhalten tritt zum Zeitpunkt der Pubertät hervor. - große Bedeutung von Lernen und Erfahrung – die Kastration eines geschlechtsreifen männlichen Tieres führt oft nicht zum Versiegen der Libido sexualis. Aus: Drews, 1993

14 AGTK Wehrend Regulation der männlichen Sexualfunktionen Hypothalamus Hypophysenvorderlappen GnRH LH FSH Hypothalamus – Hypophysen – Gonaden - Achse

15 AGTK Wehrend Endokrine Regulation der männlichen Sexualfunktion Hypothalamus Hypophysenvorderlappen Sertolizelle Hoden Leydigzelle GnRH FSH LH Inhibin Testosteron Östrogene,

16 AGTK Wehrend Hypothalamus - pulsatile Freisetzung von GnRH in das Pfortadersystem - GnRH-Sekretionsmuster sind tierartspezifisch Rüde, Bulle: pulsatil Hengst: episodenhafter, mehrstündiger Anstieg Steuerung der GnRH-Ausschüttung: - Pulsgenerator im Nucleus infundibularis - negative Rückkopplung der Sexualsteroide - saisonaler Einfluss durch Melatonin - Stress und, und, und

17 AGTK Wehrend Hypothalamus LH-Sekretionsmuster bei einem Beagle-Rüden (nach Brinkmann, 1989) LH-Sekretion folgt der GnRH-Ausschüttung

18 AGTK Wehrend Ausschaltung der GnRH-Freisetzung Hormonelle Kastration - Verabreichung von Substanzen (Hormonen), die negativ auf die GnRH-Freisetzung wirken (GnRH-Analoga, Gonadenhormone, GnRH-Antagonisten) - GnRH-Analoga: - kurzfristige Verabreichung: Stimulation der Hypophysen- Gonaden-Achse - dauerhafte Anwendung (Depotpräparate): nach kurzfristiger Stimulation Down-Regulation der GnRH-Rezeptoren - Gonadenhormone: - Auslösung des negativen Feedback - beachte gesetzliche Vorschriften z. B.: Verordnung über Stoffe mit pharmakologischer Wirkung

19 AGTK Wehrend Ausschaltung der GnRH-Freisetzung Immunologische Kastration - aktive und passive Immunisierung - aktive Immunisierung - Bildung von Antikörpern gegen körpereigenes GnRH führt zur Reduktion der gonadalen Steroidhormonbiosynthese Probleme: - GnRH hat nur geringe Molekülgröße (Dekapeptid, 1,18 kDa) - antigene Eigenschaften erst ab 5 kDa - Kopplung an ein größeres Trägerprotein - kommerzielle Vakzinen im Ausland verfügbar

20 AGTK Wehrend Hypophysenvorderlappen (Adenohypophyse) Hypophysenhinterlappen (Neurohypophyse) Hypophysenzwischenlappen Hypophyse Ausschüttung von LH (Luteinisierendes Hormon) und FSH (Follikelstimulierendes Hormon) - identische Hormonstruktur wie beim weiblichen Tier - negative Rückkopplung durch gonadale Steroidhormone - selektive Hemmung der FSH-Ausschüttung durch Inhibin

21 AGTK Wehrend LH (Luteinisierendes Hormon) - Rezeptoren auf den Leydigzellen - Steuerung der Steroidhormonsynthese FSH (Follikelstimulierendes Hormon) - Rezeptoren auf den Sertolizellen - wichtig für die frühe Phase der Spermatogenese - stimuliert in der Pubertät die Proliferation der Sertolizellen

22 AGTK Wehrend Hoden, Testis Nebenhodenkopf Samenleiter Nebenhodenkörper Nebenhodenschwanz Rete testis Samenkanälchen Aus: von Engelhardt und Breves, 2005

23 AGTK Wehrend Hoden, Testis - germinative Funktion: Bildung und Freisetzung der männlichen Keimzellen - endokrine Funktion:Bildung und Freisetzung von Hormonen Androgene, Östrogene, Inhibin Spezifische Zelltypen: - germinativen Zellen unterschiedlicher Entwicklungsstufen - Leydigzellen - Sertolizellen Aus: von Engelhardt und Breves, 2005

24 AGTK Wehrend Leydigzellen - im Interstitium des Hodens - Produktion von Androgenen aber auch von Östrogenen (Eber, Hengst) - wichtigstes Androgen: Testosteron - häufig Wirkung über Dihydrotestosteron Androgene diffundieren in die Hodentubuli und ins Blut Spermatogenese - Verhalten (Libido sexualis) - sekundäre Geschlechtsmerkmale - Wachstum - negative Rückkopplung (Hypothalamus, Hypophyse) - im Blut zum größten Teil am Sex hormon binding Globulin gebunden

25 AGTK Wehrend Sertolizellen - Ammen für die germinativen Zellen (Kompartimentierung, Ernährung) - Synthese der Tubulusflüssigkeit, Inhibin, Androgen bindendes Protein (ABP) - Bestandteil der Blut-Hodenschranke - FSH-Rezeptoren Inhibin ABP Negative Rückkopplung auf FSH - bindet Androgene - transportiert Androgene Hoden Nebenhoden

26 AGTK Wehrend Immunologie des Hodens - während der Spermatogenese werden keimzellspezifische Antigenen auf den meiotischen und postmeiotischen Zellen exprimiert - Schutz der Keimzellen durch die Blut-Hoden-Schranke und ein immunsupprimiertes Mikroklima - Störungen des immunologischen Schutzes führen zur: - Autoimmunreaktion - Bildung von Spermienantikörpern immunologisch bedingte Infertilität

27 AGTK Wehrend Pubertät - Periode zwischen Beginn der Ausprägung der sekundären Geschlechtsmerkmale bis zum Eintritt der Geschlechtsreife Geschlechtsreife - Lebensabschnitt, der durch die Möglichkeit einer erfolgreichen Fortpflanzung gekennzeichnet ist - Kennzeichen: befruchtungsfähige Spermien im Ejakulat Zuchtreife - Lebensabschnitt, der durch die Möglichkeit einer erfolgreichen Fortpflanzung gekennzeichnet ist. - konstantes Fortpflanzungsniveau - Nach Erreichen der Zuchtreife ist die körperliche Entwicklung noch nicht abgeschlossen.

28 AGTK Wehrend Pubertät - fetal: Wirkung der Androgene für die Geschlechtsdifferenzierung - mit Eintritt in die Pubertät: - Zunahme der pulsatilen GnRH-Ausschüttung - Desensibilisierung der negativen Rückkopplung - Zunahme der Gonadotropin-Ausschüttung - höhere Steroidhormonkonzentrationen - Beginn der Spermatogenese Einfluss: Körpermasse, u. a.

29 AGTK Wehrend Pubertät Allgemeine Darstellung der endokrinen Veränderungen bis zur Erlangung der Geschlechtsreife beim männlichen Tier (nach Döcke, 1994 )

30 AGTK Wehrend Pubertät Hormonkonzentrationsverläufe im Plasma von vier Bullen während Erlangung der Geschlechtreife (nach Schams et al., 1981)

31 AGTK Wehrend Spermatogenese Prinzip: - Reduktion des Chromosomensatzes (diploid – haploid) - Neukombination der Erbsubstanz (Crossing-over) - Vermehrung ausgehend von einer Stammzelle - Ausbildung einer Zelle mit der Fähigkeit der Bewegung, die die Aufgabe übernimmt, genetisches Material zu übertragen drei Stufen: - mitotische Proliferation und Differenzierung der diploiden Keimzellen (Spermatogonien) - meiotische Reifeteilung - Transformation der Spermatiden in Spermien (Spermiogenese)

32 AGTK Wehrend Spermatogenese Entwicklungsstufen der Keimzellen: - Primordialkeimzelle - Spermatogonien - primäre Spermatozyten (Spermatozyten 1. Ordnung) - sekundäre Spermatozyten (Spermatozyten 2. )Ordnung - Spermatiden (rund und elongiert) - Spermatozoen (Spermium)

33 AGTK Wehrend Nomenklatur Spermatogenese: Entwicklung der Spermien aus der Spermatogonie Spermiogenese: Entwicklung von der Spermatide zum Spermium Spermium, Spermatozoon (Plural: Spermatozoen): reifer männlicher Gamet, Samenzelle Ejakulat: Samenflüssigkeit = Spermien + Sekret der akzessorischen Geschlechtsdrüsen + anderes

34 AGTK Wehrend Primordialkeimzelle zur Spermatogonie - Einwanderung in die Gonadenanlage - mitotische Teilungen und Differenzierung zu Spermatogonien - meiotischer Block bis zur Pubertät - Spermatogonien liegen der Basalmembran auf Aus: von Schnorr und Kressin, 2001

35 AGTK Wehrend Spermatogonie zur Spermatozyte 1. Ordnung - Spermatogonien vermehren sich durch mitotische Teilungen (adulte Vermehrungsphase) - Unterschieden werden: Spermatogonien Typ A intermediäre Spermatogonien Spermatogonien Typ B Eintritt in die Pubertät Basalmembran

36 AGTK Wehrend Spermatogonie - Stammzellen der männlichen Gameten Spermatozyte 1. Ordnung - diploid - vergrößern sich - treten in die Meiose ein Eintritt in die Pubertät

37 AGTK Wehrend Spermatozyte 1. Ordnung zur Spermatide - größte Zellen im Keimepithel - nach Crossing-over entstehen aus jeder Spermatozyte 1. Ordnung zwei Spermatozyten 2. Ordnung (haploid) - durch Teilung entstehen aus jeder Spermatozyte 2. Ordnung zwei Spermatiden Gynäkospermien Androspermien

38 AGTK Wehrend Unterschiede zwischen Gynäkospermien und Androspermien - DNS-Gehalt (nach Johnson et al., 1998) Tierart% im DNS-Unterschied Chinchilla7,5 Schaf4,2 Rind 3,8 Schwein3,6 Kaninchen3,0 Mensch2,8 - Gynäkospermien sind größer - Gynäkospermien werden stärker von der Kathode angezogen Bedeutung hat das Sexing von Spermien aufgrund der DNS- Unterschiede mit Hilfe der Durchflusszytometrie

39 AGTK Wehrend Prinzip des Spermiensexing mittels Durchflusszytometrie - Markierung der Spermien mit einem fluoreszenten DNS- Farbstoff - Anregung der Fluoreszenz mit einem Laserstrahl - Fluoreszenz wird in Impulse zur Aufladen der Sperminen umgesetzt - Spannungsimpuls ist proportional zur Fluorenszenzstärke - Ablenkung in einem elektrischen Feld – Sortierung Erfolge bei verschiedenen Tierarten: Rind, Schwein, Kaninchen

40 AGTK Wehrend Prinzip des Spermiensexing mittels Durchflusszytometrie Aus: Geldermann, 2005

41 AGTK Wehrend Probleme in der praktischen Anwendung des Spermiensexing - Schädigung durch die Markierung und Sortierung - Sortierungsgeschwindigkeit dauert zu lange, um eine konventionelle Besamungsportion herzustellen Schwein: bei einer Spermienzahl von 2 Milliarden pro Portion wäre eine Sortierdauer von 200 Stunden notwendig daher: Besamung in die Gebärmutterhornspitze notwendig

42 AGTK Wehrend Spermatiden - über Interzellularbrücken miteinander verbunden Spermatozyte 2. Ordnung - kaum zu finden, da die Differenzierung zu Spermatiden sehr schnell geht

43 AGTK Wehrend Spermatide zum Spermium (Spermiogenese) - Ausgestaltung des Spermienkopfes - Kondensation des Chromatins - Verlust von Zytoplasma - Bildung des Akrosoms - Entwicklung der Geißel Unterscheidung folgender Phasen: - Golgi-Phase - Kappenphase - Akrosomphase - Reifungsphase Es schließt sich die Freisetzung der Spermien in das Tubulslumen an (Spermiation)

44 AGTK Wehrend Nenne Unterschiede zwischen der Spermatogenese und Ovogenese? Aus: Schnorr, Kressin 2001

45 AGTK Wehrend Aufbau des Spermiums Grobgliederung:Kopf I HalsII MittelstückIII Hauptstück EndstückIV

46 AGTK Wehrend Spermienkopf Akrosom: - leitet sich vom Golgi-Apparat ab - enthält hydrolytische Enzyme werden bei der Akrosomenreaktion frei - postakrosomale Membran: der nicht vom Akrosom bedeckte Teil des Kernes fusinogene Region

47 AGTK Wehrend Spermienkopf Kern: - hochkondensiertes Chromatin Plasmamembran: - relativ hoher Cholesterinanteil (Härtung der Membran) - regionale Unterschiede im Membranaufbau, die sich im Laufe der Spermienreifung verändern

48 AGTK Wehrend Hals - Abgrenzung zum Kopf durch die Basalplatte - bewegliches Gelenkstück - Lage des proximalen Zentriols (wird bei der Befruchtung an die Eizelle weitergeben) - vom Hals aus durchläuft das Axonema (Skelett) den Schwanz - Aufbau des Axonema: - zwei zentrale Tubuli - neun periphere Doppeltubuli

49 AGTK Wehrend Mittelstück - spiralige Anordnung von Mitochondrien - liefern die Energie für die Bewegungen - Abschluss des Mittelstückes durch den Anulus (Schlussring) Hauptstück Endstück

50 AGTK Wehrend Vorgänge nach der Spermiation - Transport in den Nebenhoden - Nebenhodenreifung - Ejakulation - Spermiendeponierung - Spermientransport - Spermienselektion - Kapazitation - Befruchtungskaskade siehe Vorlesung: Fortpflanzung 5. Semester

51 AGTK Wehrend Transport in den Nebenhodenhoden und Nebenhodenreifung - Spermien aus dem Hoden sind noch nicht bewegungs- und befruchtungsfähig - passiver Transport in den Nebenhoden - Vorgänge im Nebenhoden: - Transport - Reifung - Speicher Was bedeutet Nebenhodenreifung? Beispiele - Veränderung der Membran - Beeinflussung des Stoffwechsels - zunehmende Kernkondensation - Veränderung der Spermienoberfläche – Austausch und Anlagerung von Proteinen - Verlust von Zytoplasmaresten (Zytoplasmatropfen) Kopf und Körper Schwanz

52 AGTK Wehrend Energiestoffwechsel der Spermien - speziesspezifische Besonderheiten - Unterschiede im Sauerstoffbedarf beim Schwein: kaum anaerobe Glykolyse, daher schnell Abfall der Bewegungsaktivität bei der Motilitätsbeurteilung

53 AGTK Wehrend Ejakulation - Ausstoßung von Ejakulat, dabei wird den Samenzellen das Sekret der akkzessorischen Geschlechtsdrüsen zugesetzt - Ausstoßung des Ejakulates durch Kontraktionen glatter Muskelzellen (Nebenhoden, Samenleiter, akkzessorischer Geschlechtsdrüsen) - der Ejakulation geht die Erektion voraus

54 AGTK Wehrend Akkzessorische Geschlechtsdrüsen - Flüssigkeit und spezifische Moleküle, die Aufgaben an den Sperminen und im weiblichen Genitale erfüllen - Beachte tierartliche Unterschiede BulleBockEberHengstRüdeKater Samenleiter- ampullen ++-+-- Samenblasendrüse ++++-- Prostata - Corpus - Pars disseminata (+)-++++ +++--- Bulbourethraldrüse +-++-+

55 AGTK Wehrend Erektion Sildenafil blockiert

56 AGTK Wehrend Spermiendeponierung Wiederkäuer:Scheidenbesamer Schwein:Zervixbesamer Pferd:Uterusbesamer Fleischfresser:Scheidenbesamer Zur Spermagewinnung ist es notwendig, die Paarungsreflexkette auszulösen und am Laufen zu halten.

57 AGTK Wehrend Spermientransport - passiv durch Uteruskontraktionen - aktiv durch Eigenbewegungen der Samenzellen - während des Transportes in die Spermienspeicher kommt es zum Verlust und zur Selektion - mechanische Barrieren - retrograder Transport - Phagozytose durch einwandernde Leukozyten Hunter und Greve, 1998

58 AGTK Wehrend Speicherung der Spermien - Aufbau eines Spermiendepots am Übergang von Eileiter zum Uterus (uterotubale Verbindung) - Ort der Kapazitation - enge Interaktion mit dem Eileiterepithel - Freisetzung wird durch lokale Mechanismen im Eileiter gesteuert - Ablösung aktiv durch Eigenbewegung der Spermien

59 AGTK Wehrend Kapazitation Def.: zellbiologischer Reifungsprozess, durch den die Spermien ihre Befruchtungsfähigkeit erlangen Fähigkeit zur:- Akrosomenreaktion - hyperaktive Bewegungsformen - kapazitierte Spermien haben nur noch eine begrenzte Lebensspanne Prinzip: - Entfernung von stabilisierenden Elementen - Vorbereitung für die Befruchtungskaskade Was passiert? - die Plasmamembran wird reaktiver – Cholesterinefflux - Bildung bestimmter Domänen auf (in) der Plasmamembran - Influx von Kalzium