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1/37 Pharmakogenomik Dr. Peter Ahnert 07.11.2007.

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1 1/37 Pharmakogenomik Dr. Peter Ahnert

2 2/37 Übersicht Definition Pharmakogenomik Pharmakogenomik und Wirkstoffentwicklung Identifizierung der genetischen Komponente einer Erkrankung Assoziationsstudien Genetische Variabilität Struktur von Assoziationsstudien Kandidatengen-Selektion SNP-Auswahl Genotypisierung Datenanalyse Genomweite Studien Beispiele

3 3/37 Pharmakogenomik – Eine Definition Pharmakogenomik verbindet Pharmakologie mit (genomweiter) Genetik (Genomik). Verbindet die Erbanlagen von Individuen mit deren Suszeptibilität für Erkrankungen und ihrer Reaktion auf Wirkstoffe und Behandlungsmethoden um die Entwicklung und Anwendung neuer Wirkstoffe und Therapien zu unterstützen. Krankheitsätiologie and Pathogenese Wirkstoff - Target Interaktionen Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen Wirkstoffmetabolismus Basiert auf humaner genetischer Variabilität in:

4 4/37 Pharmakologie zu Pharmakogenomik Wirkstoffentwicklung ist teuer Rationale Wirkstoffentwicklung ist schwierig Wirkstoffe werden für Durchschnittsbürgerentwickelt – % non-responders – ~ Todesfälle in den USA pro Jahr – Frauen – Kinder Probleme: Pharmakologie:Entwicklung und Bereitstellung von Wirkstoffen, die es ermöglichen gesund zu werden oder zu bleiben. Pharmakogenomik!? Lösung: Wirkstoffe für bestimmte Gruppen von Individuen entwickeln und anwenden; Verlangt die Zuordnung von Individuen zu diesen Gruppen.

5 5/37 Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung Ziele: Verständnis von Krankheitsmechanismen Drug Targets Biomarker Marker für Toxizität und Wirksamkeit Marker für Differentielle Diagnostik Unterstützung von Therapie-Entscheidungen

6 6/37 Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung Phase IPhase IIPhase IIIPhase IV Sicherheit, Wirksamkeit, Dosisfindung Klinische Studien: Wirkstoff-Screening & Kandidaten- Identifikation in vitro Validierung in vivo Validierung Toxikologische Analyse Präklinische Forschung: Biologie & Medizinische Forschung Identifizierung von Drug Targets Klinische & Biologische Krankheitsmodelle Identifizierung von Krankheitsgenen & -mechanismen Grundlagen- & Pharmazeutische Forschung: Individualisierte Medizin

7 7/37 Rationale für Pharmakogenomik Alle Erkrankungen beruhen zumindest teilweise auf Veranlagung … Erbanlagen Umwelteinflüsse Hämophilie Down-Syndrom HFI Lungenkrebs Motorradunfall Knochenbrüche Diabetes Asthma Rheumatoide Arthritis Infektionskrankheiten...

8 8/37 Spielen Genetische Ursachen eine Rolle? Zwillings und Geschwisterstudien Genomweite Kartierungsstudien Mechanistische Studien Kandidaten-Gen Assoziationsstudien Tiermodelle Zur Identifizierung von: - Im Krankheitsgeschehen implizierten biologischen Prozessen - Wirkstoff Targets - Diagnostischen Markern - Toxikologischen Markern

9 9/37 Zwillingsstudien 1 … Einfluss der Umweltbedingungen 2 … Einfluss zufälliger Größen 3 … Einfluss von Umwelt und Genen 4 … Einfluss der Veranlagung Durch den Vergleich der Häufigkeit des Auftretens der Krankheit bei Geschwistern unter verschiedenen Bedingungen lässt sich die Rolle der Veranlagung abschätzen

10 10/37 Genomweite Kopplungskartierung

11 11/37 Mechanistische Untersuchungen

12 12/37 Kandidatengen-Assoziationsstudien Spielen Varianten eines Gens eine Rolle in einer Erkrankung? Genetische Variation Komplexe Phänotypen Morphologie Expression: Gene, ncRNA Umwelt Proteom Epigenetik

13 13/37 Chromosomenaberrationen Mutationen Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Insertionen und Deletionen Copy Number Variation Repeats (meist nicht kodierend) -Megasatelliten(mehrere kbp,Blocks bis 100e kbp) -Satelliten(5-171 bp,Blocks 100 kbp bis Mbp) -Minisatelliten(6-64 bp,Blocks 0,1 – 20 kbp) -Microsatelliten(1-4 bp,Blocks bis 150bp) Repetitive kodierende DNA Variable Number Tandem Repeats (VNTRs) Transposable Elements Variable Elemente des Genoms

14 14/37 SNPs und Humane Genetische Variabilität ~ 3 Mrd. Basenpaare ~ 99.9 % Identität zwischen Individuen ~ 3 Millionen Basenunter- schiede zwischen Individuen SNP... Single Nucleotide Polymorphism ACGTCTATGCATAGCTAG TGCAGATACGTATCGATC ACGTCTATTCATAGCTAG TGCAGATAAGTATCGATC

15 15/37 Clinical Data Aufbau Genetischer Assoziationsstudien Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Research into Causations Drug Targets Verification Studies Personalized Medicine Diagnostics Verification Studies Clinical Problem Clinical Study Clinical-Biological System Candidate Genes Analysis & Gene Selection Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Genotype Data Assay Design & Genotyping SNP Retrieval

16 16/37 Kandidatengene Genfunktion Genetische Kartierung Funktionelle Biologie/Biochemie Genexpression Krankheits Loci Proteomik Studien in Tiermodellen Identifizierung von Kandidatengenen

17 Datenbanken mit Information zu Gen-Eigenschaften

18 18/37 Umfassende (automatisierte) Literatur Analyse

19 19/37 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien Clinical Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Clinical Problem Clinical Study Clinical-Biological System Candidate Genes Analysis & Gene Selection Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Genotype Data Assay Design & Genotyping SNP Retrieval

20 20/37 Identifizierung, Bewertung und Auswahl von SNPs Ausgewählte SNPs sollten: - Die häufigsten Varianten eines Gens detektieren - Mit hoher Wahrscheinlichkeit Einfluss auf die Funktion des Genproduktes haben

21 21/37 Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics Aug 5 SNPs zur Detektion Wichtiger Genvarianten Die Haplotyp-Struktur des Genoms:

22 22/37 Funktionelle Veränderungen durch SNPs Nebenbei: Einblick in die Evolution

23 23/37 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien Clinical Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Clinical Problem Clinical Study Clinical-Biological System Candidate Genes Analysis & Gene Selection Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Genotype Data Assay Design & Genotyping SNP Retrieval

24 24/37 Genotypisierungsmethoden Sequenzierung Minisequenzierung Pyrosequenzierung Single Base Extension (SBE) TaqMan Invader MLPA Hoch- und niedrigdichte Oligo-DNA Hybridiserungsarrays Allelspezifische Primerextension Allelspezifische Enzymreaktion Allelspezifische Hybridisierung Die verschiedenen Detektionsmethoden basieren vor allem auf: - Fluoreszenz - Massenspektrometrie - Chemolumineszenz - Fluoreszenzpolarisation

25 25/37 ddNTPs C T A PCR product SBE primer Biotin G Single base Extension SBE primer G Streptavidin Product Purification G UV SBE primer Photocleavage +G MALDI-TOF MS Genotypisierung - Single Base Extension

26 26/37 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien Clinical Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Clinical Problem Clinical Study Clinical-Biological System Candidate Genes Analysis & Gene Selection Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Genotype Data Assay Design & Genotyping SNP Retrieval

27 27/37 Klinische DatenGenetische Daten Daten Analyse – Wie sehen die Daten aus?

28 28/37 Analyse Einzelner Polymorphismen Vergleich von Allelfrequenzen mit Chi-Quadrat Analyse Vergleich von Genotypfrequenzen mit Chi-Quadrat Test auf Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) Vererbung berücksichtigende Tests Transmission Disequilibrium Tests (TDT) Affected Family Based Controls (AFBAC) Genetisches Relatives Risiko (GRR)...

29 29/37 Clinical Bar CodesGenetic Bar Codes Patient 1 Patient 2 Patient 3 Schrittweise Progressive Regression Klassifikation (Support Vector Machines, Neuronale Netze) Mustererkennung Musteranalysen

30 30/37 Herausforderungen bei der Analyse der Genetik Polygener Phänotypen Phänotyp-Bestimmung Sehr geringe Penetranz einzelner Genvarianten (Common Disease – Common Variant vs. Common Disease – Rare Variant ) Geringe Penetranz von Haplotypen Genomweite Variantenmuster (GVPs) GVP-Subgruppen für einen Phänotyp Erreichen genomweiter statistischer Signifikanz

31 31/37 Genomweite Studien

32 32/37 Bekannte Assoziationen

33 33/37 Polygenische Erkrankungen Rhesus hemolytic disease: - interaction of 2 mendelian loci: D and ABO - relatively simple and well understood Hirschsprung Disease: - absence of ganglia in the large intestine or colon - so far 5 loci implicated Breast Cancer: - now segregated into a rare near-mendelian form (BRCA1 & 2) and a more common sporadic form Type 1 Diabetes Mellitus: - autoimmune destruction of pancreatic -cells - strong association to HLA-DR3 & DR4 alleles - strong association to non-Asp in DQB1 pos Monozygotic twin concordance 30 %

34 34/37 Pharmakogenetischer Test Warfarin -Blutverdünner z.Bsp. bei Schlaganfallrisiko -Stärkere Reaktion bei ca. 1/3 der Patienten - 25 % Varianten im Vitamin K Epoxidreduktase Komplex 1 Gen (VKORC1) - 10 % Varianten im Cytochrom P450 (CYP2P9) -Ca. 2 Mill neue Patienten pro Jahr -Individuelle Anpassung der Dosierung durch Trial & Error - Alter - Gewicht - Ernährung - Medikamente - Genetik -FDA: genetische Tests könnten - Pro Jahr Blutungsereignisse verhindern - Pro Jahr Schlaganfälle verhindern -Am durch die FDA in den USA zugelassen

35 35/37

36 36/37 Phänotyp - Genotyp Analyse der Rheumatoiden Arthritis Autoimmunerkrankung: Progressive Gelenkzerstörung Etwa 1% der Bevölkerung betroffen Lebenserwartung um Jahre reduziert Ätiologie nicht genau bekannt Genetische Suszeptibilität 30-60%

37 37/37 Warum sollte die RA-Genetik untersucht werden? Frühdiagnose Therapieentscheidungen Differentialdiagnose Voraussage der Progression Verständnis der biologischen Prozesse in Ätiologie und Pathogenese Neue Behandlungsstrategien

38 38/37 Rheumatoid Arthritis - Etiology and Pathogenesis TNF IL-1 Dinarello C.A., Moldawer L.L. Amgen 1999, Proinflammatory and Anti-inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis; with Modifications by Ulrich Sack Synovial membrane Lining cells T-cells, M T-cells & B- cell activation unknown antigens other risk factorsgenetic predisposition Activation Adhesion Permeabilization Migration of inflammatory cells Pannus formation Production of Collagenases (MMPs) by fibroblasts, chondrocytes and osteoclasts Joint destruction Cytokines Mediators

39 39/37 Linkage Possible Linkage Likely No linkage Il2 IL6R PRG4 CD8A IL18R1 CTLA4 IL5R CCR5 CSF2;Il4; Il5; Il13; IRF1 IL6 CRH HSPA1L; LTA; LTB, MICA PRL HLA Kopplungs-Loci und Kandidatengene in RA

40 40/37 Unsere Bisherigen Resultate Suszeptibilitätsanalyse rheumatoide Arthritis: ~180 SNPs in ~50 Kandidatengenen Genotypisierung in 500 Proben > Genotypen Kapazität: ~3000 Genotypen pro Tag >98% erfolgreiche Genotypisierung <0.1% falsche Bestimmungen (PedCheck) mehrere mögliche Assoziationen einzelner SNPs einige Assoziationen konnten bestätigt werden Geninteraktionsanalyse läuft

41 41/37 Genotypisierung - TaqMan

42 42/37 Genotypisierung - Weitere Techniken … Invader Assay Pyrosequencing


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