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1 Seminar 1 Nachweis des Proteins NHE-7 in roten Blutzellen Claudia Hahn 25.04.2012.

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Präsentation zum Thema: "1 Seminar 1 Nachweis des Proteins NHE-7 in roten Blutzellen Claudia Hahn 25.04.2012."—  Präsentation transkript:

1 1 Seminar 1 Nachweis des Proteins NHE-7 in roten Blutzellen Claudia Hahn

2 2 Inhalt Na + /K + -Transport Leak-Transport NHE Familie Versuchsabläufe Referenzen

3 3 K+K+ Na + K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ K+K+

4 4 K+K+ Na + K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ H+H+ K+K+ K+K+ K+K+ NHE Familie Na + H+H+ H+H+ H+H+ H+H+

5 5 Na + K+K+ K+K+ K+K+ H+H+ K+K+ K+K+ K+K+ NHE Familie Na + K+K+ H+H+ H+H+ Na + -K + -Transport

6 6 K+K+ Na + K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ K+K+ NHE Familie Na + K+K+ Na + -K + -Transport K+ Leak-Transport Na +, K +

7 7 Na + /K + -Transport Natrium-Kalium-Pumpe 3 Natrium raus 2 Kaliumrein unter ATP Verbrauch (gegen Konzentrationsgefälle)

8 8 Leak-Transport Definition: Unidirektionaler K + und Na + Einfluss und Ausfluss während alle bekannten Transportwege (Pumpen, Kanäle, Carrier) inhibiert sind durch Ouabain + Bumetanide + EGTA Na + /K + Pumpe, der Na + /K + /2Cl - Kotransport und der Ca 2+ -aktivierte K + Kanal sind inhibiert Der "leak" Na + Fluss ist komplizierter als der "leak" K + Fluss Größere Anzahl von spezifischen Transportsystemen Der "leak" K + und Na + Transport kann nicht über Elektrodiffusion erklärt werden

9 9 NHE Transmembrane Antiporter (Na + /H + Austauscher) Regulieren den pH-Wert und die Ionenhomöostase Wird durch verschiedene Signalwege reguliert Hoch konserviert bei den Säugetieren Neun Isoformen NHE1 bis NHE9

10 10 Zwölf transmembrane Segmentantiporter Im neutralen pH sind die NHEs inaktiv; Aktivierung erfolgt bei Ansäuerung Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia Struktur des Na + /H + Austauschers

11 11 NHE-Familie NHE 1 in nahezu allen Geweben, Zelltypen und Spezies Konstanthaltung von pH und Zellvolumen Reguliert die Proliferation Aktivierung des Na + /H - -Austauschs durch intrazelluläre Säurebelastung NHE 2 vor allem im Gastrointestinaltrakt (Magen und Darm) ähnliche Aufgaben wie NHE1

12 12 NHE 3 Beim Menschen in Niere und Dünndarm, aber auch in vielen anderen Geweben zu finden Volumenregulation NHE 4 beim Kaninchen im Magen exprimiert, mittelstark im Dünndarm und Kolon und schwach in Niere, Gehirn, Herz, Uterus, Skelettmuskel und Leber Könnte an der Volumenregulation beteiligt sein

13 13 NHE 5 im Gehirn hoch exprimiert NHE 6 nur in den Mitochondrien, Herz, Gehirn, und Skelettmuskel pH-, Volumen- und Elektrolytregulation

14 14 NHE-7 kommt im Golgi-Netzwerk, Endosomen und Plasmamembran vor reguliert die Ionenhomöostase Durch intrazelluläre Akkumulation von Ca-Ionen und die Bindung von Calmodulin (CaM) aktiviert (Bindung an IL2)

15 15 Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

16 16 Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

17 17 NHE-8 Am proximalen Tubulus der Niere entdeckt im ER (endoplasmatisches Retikulum) und bis zum trans Golgi nachweisbar Elektrolyttransport NHE9 Im späten Endosom

18 18 Versuchsablauf Gewinnung von Blut Isolierung der Membranproteine Trennung der Proteine nach Größe mittels SDS-Page Anfärben über Coomassie-blau Western Blot Detektion mit Antikörpern

19 19

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22 22 Proteine roter Blutkörperchen nach der SDS-Gelektrophorese und Coomassie-Färbung Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

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25 25 Western Blot zum Nachweis des NHE 7 mit Antikörpern Diplomarbeit Jennifer Lang, Universität des Saarlandes

26 26 Ausblick Weitere Nachweise mittels verschiedener Methoden: MALDI-ToF Kapillarelektrophorese Flüssigchromatographie Polymerase-Kettenreaktion

27 27 Referenzen Attaphitaya S, Park K and Melvin JE. Molecular cloning and functional expression of a rat Na+/H+ exchanger (NHE5) highly expressed in brain. J Biol Chem 274: , Baird NR, Orlowski J, Szabo EZ, Zaun HC, Schultheis PJ, Menon AG and Shull GE. Molecular cloning, genomic organization, and functional expression of Na+/H+ exchanger isoform 5 (NHE5) from human brain. J Biol Chem 274: , Bookstein C, DePaoli AM, Xie Y, Niu P, Musch MW, Rao MC and Chang EB. Na+/H+ exchangers, NHE-1 and NHE-3, of rat intestine. Expression and localization. J Clin Invest 93: , Bookstein C, Musch MW, DePaoli A, Xie Y, Rabenau K, Villereal M, Rao MC and Chang EB. Characterization of the rat Na+/H+ exchanger isoform NHE4 and localization in rat hippocampus. Am J Physiol 271: C , Goyal S, Vanden Heuvel G and Aronson PS. Renal expression of novel Na+/H+ exchanger isoform NHE8. Am J Physiol 284: F467-F473, 2003.

28 28 Hoogerwerf WA, Tsao SC, Devuyst O, Levine SA, Yun CH, Yip JW, Cohen ME, Wilson PD, Lazenby AJ, Tse CM and Donowitz M. NHE2 and NHE3 are human and rabbit intestinal brush-border proteins. Am J Physiol 270: G29-41, Kapus A, Grinstein S, Wasan S, Kandasamy R and Orlowski J. Functional characterization of three isoforms of the Na+/H+ exchanger stably expressed in Chinese hamster ovary cells. ATP dependence, osmotic sensitivity, and role in cell proliferation. J Biol Chem 269: , Lang J, Untersuchungen zur Existenz von NHE-Isoformen in Plasmamembranen humaner Erythrozyten 2012 Numata M and Orlowski J. Molecular cloning and characterization of a novel Na+,K+/H+ exchanger localized to the trans-Golgi network. J Biol Chem 276: , Numata M, Petrecca K, Lake N and Orlowski J. Identification of a mitochondrial Na+/H+ exchanger. J Biol Chem 273: , Pizzonia JH, Biemesderfer D, Abu AA, Wu MS, Exner M, Isenring P, Igarashi P and Aronson PS. Immunochemical characterization of Na+/H+ exchanger isoform NHE4. Am J Physiol 275: F510-F517, Popova M. Characterization of the interaction between Na/H Exchanger Isoform 7 (NHE-7) and Calmodulin (CAM). The university of british Columbia. 2007

29 29 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit

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