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Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden 29.04.2009 Dr. Monika Knödlseder 1 Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden.

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1 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 1 Leistungspotentiale und Grenzen mikrobiologischer Methoden – dargestellt anhand konkreter Beispiele muva kempten Dr. Monika Knödlseder

2 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 2 Beispiele: -Bifidobakterien -Laktobazillen -Cronobacter -PCR

3 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 3 Bifidobakterien

4 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 4 Bifidobakterien -werden häufig in probiotischen Produkten eingesetzt -keine offizielle spezifische Nachweismethode für Bifidobakterien -ISO-Vorschlag in Bearbeitung ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E)

5 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 5 Bifidobakterien ISO/FDIS 29981/IDF 220:2009 (E) -Für Milchprodukte -IDF – Ringversuch Labore (Europa, Japan und Neuseeland) -Nährboden TOS-MUP Medium TOS Agar mit Li Mupirocin (MUP) - Begleitflora wird gehemmt (Streptococcus thermophilus, Laktobazillen) - Wachstum von Bifidobakterien wird gefördert

6 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 6 Bifidobakterien Nachweis mit TOS-MUP-Agar: Probe: Milchprodukte (z.B. Milchpulver, Starterkultur) Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung Gussplattenverfahren ml TOS-MUP-Agar Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur Evtl. F6PPK Assay Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: -Alle Platten mit 300 Gesamt-Kolonien Bifidobakterienstämme können unterschiedliche Koloniegrößen und Koloniemorphologien auf dem Nährmedium zeigen

7 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 7 Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.

8 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 8 Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien - Methodenvergleich Methode 2 -ISO-Vorschlag - Nachweis mit TOS- MUP- Agar - Gussplattenverfahren - anaerob Methode 1 - muva-Methode - Nachweis mit RCM-Agar - Spatelverfahren - anaerob

9 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 9 Bifidobakterien Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen hoher Anteil Begleit- flora auf RCM-Agar

10 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 10 Bifidobakterien Zusammenfassung ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber: RCM - AgarTOS - MUP - Agar Kolonieform stark produktabhängig oft schwer von Begleitflora abzu- grenzen häufig sehr kleine Kolonien produktunabhängig große, deutlich erkennbare Kolonien Mikroskopisches Bild z. T. nicht eindeutig -> weitere Differenzierungen eindeutig Begleitflora (Laktobazillen, Streptokokken) meist stark vorhanden wenig Eignung der Methode prinzipiell geeignet z. T. aufwendige Differen- zierung erforderlich methodische Erfahrung sehr gut geeignet i. d. R. keine weitere Differenzierung notwendig

11 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 11 Bifidobakterien Nachteil: -Bezug des Nährbodens in Japan -kein europäischer Anbieter (derzeit)

12 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 12 LAKTOBAZILLEN

13 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 13 gleiche Methode – gleiche oder unterschiedliche Ergebnisse ?! am Beispiel LAKTOBAZILLEN

14 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 14 Laktobazillen Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003) Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung - Spatelverfahren auf MRS - Agar pH 5,4 Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: - Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie -> KOH: negativ -> Katalase: negativ - Zählen der Platten (10 bis < 300 Gesamt-Kolonien) Identifizierung der Spezies: - ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem api 50 CH (bioMerieux) oder FTIR-Spektroskopie

15 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 15 Laktobazillen Produkt Joghurt MRS-MerckMRS-DifcoMRS-HeiphaMRS-Sifin KBE/gFTIR-Ident.KBE/gFTIR-Ident.KBE/gFTIR-Ident.KBE/gFTIR-Ident. Probe Lb. acidophilus Lb. acidophilus Lb. acidophilus Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Lb. delbrueckii Lb. delbrueckii Lb. delbrueckii Probe Lb.delbrueckii62.000Lb. delbrueckii63.000Lb. delbrueckii60.000Lb. delbrueckii Probe Lb. delbrueckii Lb. delbrueckii Lb. delbrueckii Lb. delbrueckii Probe Lb.delbrueckii Lb.delbrueckii Lb.delbrueckii Lb.delbrueckii Lb. acidophilus Lb. delbrueckii Probe 1 Lb. delbrueckii Probe 2 Lb. delbrueckii Probe 3 Lb. delbrueckii Probe 4 gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – gleiche Ergebnisse Maximale Abweichung: 23% 23% 25% 10% 28% 25%

16 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 16 Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse Matrix MRS - MerckMRS - DifcoMRS - Heipha KBE/gFTIR-Ident.KBE/gFTIR-Ident.KBE/gFTIR-Ident. Kultur Lb. delbrueckii 1.700Lb. delbrueckii * Kolonien schwer abimpfbar, *Bestätigungsreaktionen möglich * keine FTIR - Identifizierung * Kolonien schwer abimpfbar * Bestätigungsreaktionen möglich * keine FTIR - Identifizierung Joghurt 1 mit Kultur 600Lb. delbrueckii Lb. delbrueckii Joghurt 2 mit Kultur Lb. delbrueckii Lb. delbrueckii Joghurt 3 mit Kultur < 100 nur Sc als Fremdflora * Laktobazillen, vermutlich Lb. delbrueckii * kein Wachstum auf FTIR - Agar Joghurt 4 mit Kultur 400Lb. delbrueckii * Laktobazillen, vermutlich Lb. delbrueckii * kein Wachstum auf FTIR - Agar

17 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 17 Laktobazillen gleiche Methode – unterschiedlicher Agar – unterschiedliche Ergebnisse Joghurtproben mit Kultur Lb. delbrueckii Kultur Lb. delbrueckii

18 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 18 Laktobazillen Zusammenfassung: 1.Die Vergleichsuntersuchungen von über 80 Proben (4 Hersteller) mit Merck- und Difco- Agar 2.bei der Mehrheit (über 80%) der untersuchten Proben vergleichbare Keimzahl und FTIR- Identifizierungsergebnis

19 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 19 Laktobazillen Zusammenfassung: Aber: 1.in produktabhängigen Einzelfällen (4) führte die Verwendung unterschiedlicher MRS - Nährmedien zu deutlichen Abweichungen (über 80%) in der Keimzahl 2.bei ca. 95 % der Proben keine Abweichungen bei der FTIR - Analyse (identischen Spezies) 3.bei ca. 5 % der Proben keine eindeutige Übereinstimmung in der FTIR - Analyse (als Option)

20 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 20 Cronobacter – E. sakazakii

21 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 21 Enterobacter sakazakii ISO/TS IDF/RM 210:2006 Probe: -milk and milk products (milk powder and powdered infant formula) and -environmental samples collected from milk powder or infant formula factories Inkubation bei 37 ± 1 °C für 18 h ± 2 h Selektive Anreicherung in mLST/Vanvomycin Medium Inkubation bei 44 ± 0,5 °C für 24 ± 2 h gepuffertes Peptonwasser Ausstrich der mLST/vancomycin Kultur auf den chromogenen Selektivnährboden Inkubation bei 44 ± 1 °C für 24 ± 2 h Bestätigungstests

22 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 22 Prüfmittel Bsp.: Inkubationstemperatur nicht eingehalten Selektive Anreicherung bei 46 °C inkubiertSelektive Anreicherung bei 44 °C inkubiert

23 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 23 Cronobacter Technische Spezifikation ist derzeit in Überarbeitung -Optimierung des Verfahrens -Horizontales Verfahren -Derzeit in der Diskussion: - Inkubation der Selektivmedien h bei 41,5 ± 1 °C - Austausch der Selektivmedien Cronobacter screening broth (CSB) (anstelle mLST) Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar (anstelle Enterobacter sakazakii isolation agar)

24 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 24 PCR - Verfahren

25 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 25 Potential der PCR Hohe Spezifität Hohe Sensitivität Zeitgewinn gegenüber kulturellen Verfahren in der Mikrobiologie Gesamtdauer mit Anreicherung 1-2 Tage gegenüber bis zu 10 Tagen für kulturelle Verfahren Mit Multiplex - PCR mehrere Parameter gleichzeitig nachweisbar Vielseitige Einsatzmöglichkeiten Mikrobiologie GMO Tierartendifferenzierung Pathologie……

26 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 26 PCR / real – time PCR Wie geht man mit positiven Befunden um? Was macht man, wenn der Keim nicht isoliert werden kann?

27 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 27 PCR Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaftlichen Lebensmittelhygienerechts Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern (= Umsetzung der Richtlinie 2003/99/EG ) (2) Im Falle des Nachweises von Zoonoseerregern sind…. Isolate der nachgewiesenen Zoonoseerreger herzustellen die Rückstellproben des Probenmaterials die Isolate während eines von der zuständigen Behörde festzusetzenden Zeitraumes, jedoch nicht länger als drei Monate, in geeigneter Weise aufzubewahren der zuständigen Behörde auf Verlangen vorzulegen und auszuhändigen.

28 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 28 Was tun?

29 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 29 Kompetenz des Labors Bei Beurteilungen alle Aspekte berücksichtigen Laborkompetenz: Bsp. -Ringversuche -Interne Kontrollen -Prüfmittelüberwachung -Schulung - Laborbegehungen Qualitätssicherung im Labor Mikrobiologisches Fachwissen

30 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 30 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! Unser Team: Dr. Christine Bürk Dr. Ursula Hartmann Marion Seidl Isolde Degle Dr. Karlheinz Friedrich Dr. Monika Knödlseder

31 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder Chromogenic Cronobacter Isolation (CCI) agar Composition Tryptic digest of casein Yeast extract Sodium chloride (NaCl) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-glucopyranoside Sodium desoxycholate (C24H39NaO4) Ammonium iron(III) citrate (C6H8O7 Fe NH3) Sodium thiosulfate (Na2S2O3) Agar Water Kein Crystal violet

32 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder Cronobacter screening broth (CSB) Base medium Enzymatic digest of animal tissues Meat extract Sodium chloride (NaCl) (weniger) Bromocresol purple Sucrose (C12H22O11) Water Vancomycin solution

33 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 33 Bifidobakterien – Nährmedien Nachweis von Bifidobakterien: Nährmedienzusammensetzung ZusammensetzungRCM-AgarTOS-MUP-Agar Pepton tryptisch verdaut10 g Hefeextrakt3 g1 g Fleischextrakt10 g Glucose5 g Stärke1 g NaCl5 g Na-Acetat3 g Cysteinhydrochlorid0,5 g L-Cystein HCl x H 2 O 0,5 g Natriumpropionat 15 g Galactooligosaccharide 10g KH 2 PO 4 3 g K 2 HPO 4 4,8 g (NH 4 ) 2 SO 4 3 g MgSO 4 x7H 2 O 0,2 g Agar12,5 g15 g pH5,96,3 Mupirocin 50 mg/l Herstellerz.B. Merck, Oxoid, Sifin derzeit nur Yakult Pharmaceuticals, Japan

34 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 34 Laktobazillen - Nährmedien Laktobazillen – Verwendung von MRS-Agar verschiedener Hersteller MRS-Agar - Zusammensetzung g/l MerckDifcoHeiphaSifin Art.Nr TN1068 Pepton aus Casein10,00 Fleischextrakt8,00 10,00 8,00 Hefeextrakt4,00 5,00 4,00 D(+)-Glucose20,00 Dikaliumhydrogenphosphat2,00 Tween® 801,00 Di-ammonium-hydrogencitrat2,00 Natriumacetat5,00 Magnesiumsulfat0,20 0,10 0,20 Mangansulfat0,04 0,05 Agar14,00 15,00 14,0013,00

35 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 35 Übersichtsschema

36 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 36 Zählung der Kolonien und Angabe des Ergebnisses: -Zählung der Verdünnungsstufen mit mindestens einmal > 15 bis 300 Kolonien -Alle Kolonien werden gezählt -Bildung des gewogenen arithmetischen Mittels der Keimzahlwerte von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe des Ergebnisses als KbE /ml oder KbE/g -Sind in der Anfangsverdünnung weniger als 15 Kolonien gewachsen, werden alle Kolonien gezählt und das arithmetische Mittel gebildet

37 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 37 Kompetenz des Labors Externes, akkreditiertes Labor: für die entsprechenden Untersuchungsverfahren akkreditiert? Erfahrung mit der entsprechenden Probenmatrix vorhanden? Anerkanntes (akkreditiertes) Betriebslabor? Ist die Methode validiert? Nimmt das Labor erfolgreich an Ringversuchen/ Vergleichsuntersuchungen teil? Welche Untersuchungsverfahren wurden eingesetzt? (Betriebsinterne Methoden; Referenz-, validierte Schnellmethoden)

38 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 38 In der Praxis häufig als obligates Lebensmittelsicherheitskriterium eingestuft Verweis auf Kapitel 2.2 des Anhangs: Käse aus Rohmilch Käse aus Milch, wärmebehandelt … Frischkäse aus Milch …, wärmebehandelt … Milch- und Molkepulver Bei Grenzwertüberschreitung: koagulasepositive Staphylokokken > 10 5 KBE/g Untersuchung auf Staphylokokken-Enterotoxine: negativ in 25 g Staphylokokken- Enterotoxine (SET), Verordnung (EG) 2073/2005, Anhang I

39 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 39 Nachweis von SET- Problematik falschpositive r Ergebnisse In Abhängigkeit vom verwendeten Testkit sind falschpositive Resultate möglich: es ist daher unumgänglich, insbesondere schwach verdächtige Ergebnisse zu verifizieren: Zählung der Staphylokokken parallel zur SET-Bestimmung Thermonuklease-Nachweis (Hinweis auf kritische Staphylokokken-Keimzahlen noch möglich in Proben, in denen keine Staphylokokken mehr nachweisbar sind) Hitzebehandlung der Probe und erneute SET-Bestimmung (SET sind hitzestabil, unspezifische Reaktionen hervorrufende Substanzen sind häufig hitzelabil) (aus: H. Becker et al. (1994), Archiv für Lebensmittelhygiene 45; 25-48)

40 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 40 Eingesetzte Volumen für die PCR Von 5 μl bis 1 ml BAX 5 μl Roche 1 ml EHEC1 ml

41 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 41 Verordnung zur Durchführung von Vorschriften des gemeinschaft- lichen Lebensmittel- hygienerechts Artikel 4: Verordnung mit lebensmittelrechtlichen Vorschriften zur Überwachung von Zoonosen und Zoonoseerregern § 3: Betriebseigene Kontrollen (1)Wer im Rahmen von Kontrollen nach Artikel 3 Abs. 1 der Verordnung (EG) Nr. 2073/ oder anderen betriebseigenen Kontrollen Lebensmittel auf Zoonoseerreger untersucht, hat zum Zweck der Durchführung von weitergehenden Untersuchungen Rückstellproben des Probenmaterials anzufertigen und bis zum Vorliegen des Ergebnisses der Untersuchungen in geeigneter Weise aufzubewahren.

42 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 42 Bifidobakterien – Methoden- vergleich MethodeKBE/gKolonietypenMikroskopieFTIR-Identifizierung RCM-Agar 37°C groß, weiß mit glattem Rand = gezählte Kolonien kurze, unregelmäßige Stäbchen, kaum Verzweigungen, wenig keulenförmig -> uneindeutig bifid oder Lb? Bifidobacterium animalis sehr klein, durchscheinend weißlich mit ausgefranstem Rand (v.a. auf VD <5) mittellange - lange Stb, KOH neg., Kat neg. -> Lb Lb. acidophilus im Hintergrund extrem kleine "nicht definierbare" pinpoints (v.a. auf VD <5) Streptokokken oder Laktobazillen ? nicht angewachsen, keine Identi möglich RCM-Agar 42°C groß, weiß mit glattem Rand = gezählte Kolonien viele keulenförmig, oft an einem Ende aufgetrieben wie "Glühbirnen" -> eindeutig bifid Bifidobacterium animalis sehr klein, durchscheinend weißlich mit ausgefranstem Rand (v.a. auf VD <5) mittellange - lange Stb, KOH-, Kat- -> Lb Lb. acidophilus im Hintergrund extrem kleine "nicht definierbare" pinpoints (v.a. auf VD <5) Streptokokken oder Laktobazillen ? nicht angewachsen, keine Identi möglich TOS-MUP- Agar (3) Agar-Oberfläche: groß, weiß, rund, glatter Rand im Agar: eher gelblich, linsenförmig, groß auf Plattenboden: groß, weiß mit durchscheinendem "flaumigem" Rand sehr große Zellen, meist stark verzweigt, viele Y-Formen -> eindeutig bifid alle 3 Kolonietypen Bifidobacterium animalis MRS-Agar durchscheinend weißlich mit ausgefranstem Rand lange StäbchenLb. acidophilus mittelgroß, weiß mit glattem Randkurze Stäbchen in KettenLb.casei Nachweis von Bifidobakterien: Methodenvergleich detailliert Bifidobakterien Laktob.

43 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 43 Bifidobakterien – Vergleichsunter- suchungen Nachweis von Bifidobakterien: Vergleichsuntersuchungen hoher Anteil Begleit- flora auf RCM-Agar Bei gut 80% der Proben lag die Abweichung der ermittelten Keimzahlwerte unter 40%

44 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 44 Laktobazillen - Nachweis Nachweis von Laktobazillen – Spatelverfahren mit MRS-Agar (nach VDLUFA M7.16.3, 2003) Probe: fermentierte Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf MRS-Agar pH 5,4 ansetzen Inkubation: 72 ± 3 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: - Jeden Kolonietyp bestätigen als Laktobazillen: -> Mikroskopie: sporenlose Stäbchen -> KOH: negativ -> Katalase: negativ - Zählen der Platten mit i.d.R. 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien - Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g Identifizierung der Spezies: - ggf. Identifizierung der Laktobazillen-Spezies mit Testsystem api 50 CH (bioMerieux) oder FTIR-Spektroskopie

45 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 45 Grenzen der Mikrobiologie: fehlende Nachweismethode trotz speziell angepasster Inkubationsbedingungen können (vorgeschädigte) Mirkoorganismen nicht (mehr) zum Wachstum gebracht werden unterschiedliche Methoden zum Nachweis desselben Mikroorganismus können zu unterschiedlichen Ergebnisse führen unterschiedliche Vorgehensweisen oder Reagenzien innerhalb einer Methode können zu unterschiedlichen Ergebnissen führen (Bsp: Laktobazillen)

46 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 46 Methode 1 – Nachweis mit RCM-Agar: Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 0,1 ml Probe oder Verdünnung im Spatelverfahren auf RCM-Agar pH 5,9 ansetzen Inkubation: 72 ± 2 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob (bei Proben mit einem hohen Anteil Lactobacillus (para)casei: Inkubation bei 42°C) Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: porzellanweiße, leicht erhabene Kolonien mit einem Durchmesser von 1 bis 2 mm Bestätigungstests: - Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt. - KOH-Test: negativ (=grampositiv) - Katalase-Test: negativ Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: - Alle Platten mit 10 bis < 300 Gesamt-Kolonien - Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g Bifidobakterien- Nachweis

47 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 47 Bifidobakterien- Nachweis Methode 2 – Nachweis mit TOS-MUP-Agar: Probe: Milch, Milchprodukte, Molkereihilfsstoffe Herstellen der Verdünnungsreihe je 2 x 1 ml Probe oder Verdünnung im Gussplattenverfahren mit ca. 15 ml TOS-MUP-Agar (ca. 48°C, hitzesensibel!) ansetzen Inkubation: 72 ± 4 Std. bei 37 ± 1°C, anaerob Bestätigung und Zählen der Kolonien: Koloniemorphologie: Alle gewachsenen Kolonien werden gezählt Pro Kolonietyp -> mikroskopische Bestätigung der Bifidobakterienreinkultur (ggf. KOH und Katalase bei unklarer Mikroskopie) - Mikroskopie: unregelmäßige Stäbchen, zum Teil knochenförmig, Enden zum Teil keulenförmig angeschwollen oder verzweigt. - KOH-Test: negativ (=grampositiv) - Katalase-Test: negativ Zählen der Kolonien und Berechnung der Keimzahl: - Alle Platten mit 0 bis < 300 Gesamt-Kolonien - Bildung des arithmetischen Mittels von 2 aufeinanderfolgenden Verdünnungsstufen und Angabe als KbE /ml oder KbE/g

48 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 48 Leistungs- potentiale Moderne Methoden : - PCR: Salmonellenanalyse ca. 1,5 - 2 Tage Listerienanalyse ca. 2 Tage STEC ca. 2 Tage Cronobacter ca. 2 Tage - FTIR Analyse: Absorption aller Zellbestandteile Chemische Zusammensetzung des Keimes wird dargestellt definierte Wellenlängenbereiche werden für einen Fingerabdruck des Keims ausgewertet

49 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 49 Bifidobakterien – Zusammen- fassung Nachweis von Bifidobakterien – Zusammenfassung ermittelte Keimzahlwerte beider Methoden sind vergleichbar, aber: RCM-Agar 42°CTOS-MUP-Agar Kolonieform stark produktabhängig oft schwer von Begleitflora abzu- grenzen (Gefahr der Falschzu- ordnung!) häufig sehr kleine Kolonien produktunabhängig 3 Kolonietypen entsprechend Lokalisation im Agar große, deutlich erkennbare Kolonien Mikroskopisches Bild oft rel. eindeutig als bifid zu erkennen (allerdings meist keulen- förmig, wenig Verzweigungen) teilweise fraglich bifid oder Laktobazillen -> weitere Differen- zierungen nötig absolut eindeutig meist große, deutlich keulen- förmige oder stark verzweigte Zellen Begleitflora (Laktobazillen, Streptokokken) meist stark vorhanden nicht vorhanden Eignung der Methode prinzipiell geeignet benötigt aber u.U. viel Differen- zierungsarbeit und methodische Erfahrung sehr gut geeignet keine weitere Differenzierung notwendig, mikroskopische Bestätigung reicht aus

50 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 50 Laktobazillen

51 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 51 Probenahme- planung Festlegen aussagefähiger Probenahmestellen, Beispiele: Der zu untersuchende Probenteil: Käserinde bei der Untersuchung auf Listeria monocytogenes Repräsentative Probenahme / Stichproben entsprechend Anlage 1 der Verordnung (EG) 2073/2005 kritische Anlagenteile unter Berücksichtigung möglicher Biofilm- bzw. Nischenbildung Festlegen relevanter Untersuchungsparameter, Beispiel: Schmierlösung und Gully-Inhalte auf Listerien

52 Leistungspotenziale und Grenzen mikrobiologischer Methoden Dr. Monika Knödlseder 52 Bifidobakterien - Kolonie- morphologie Nachweis von Bifidobakterien: Koloniemorphologie RCM-Agar, 37°C, 72 Std.TOS-MUP-Agar, 37°C, 72 Std.


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