Pharmakogenomik Dr. Peter Ahnert

Präsentation zum Thema: "Pharmakogenomik Dr. Peter Ahnert"—  Präsentation transkript:

1 Pharmakogenomik Dr. Peter Ahnert ahnert@uni-leipzig.de

2 Übersicht Definition “Pharmakogenomik”
Pharmakogenomik und Wirkstoffentwicklung Identifizierung der genetischen Komponente einer Erkrankung Assoziationsstudien Genetische Variabilität Struktur von Assoziationsstudien Kandidatengen-Selektion SNP-Auswahl Genotypisierung Datenanalyse Genomweite Studien Beispiele

3 Pharmakogenomik – Eine Definition
Pharmakogenomik verbindet Pharmakologie mit (genomweiter) Genetik (Genomik). Verbindet die Erbanlagen von Individuen mit deren Suszeptibilität für Erkrankungen und ihrer Reaktion auf Wirkstoffe und Behandlungsmethoden um die Entwicklung und Anwendung neuer Wirkstoffe und Therapien zu unterstützen. Basiert auf humaner genetischer Variabilität in: Krankheitsätiologie and Pathogenese Wirkstoff - Target Interaktionen Bioverfügbarkeit von Wirkstoffen Wirkstoffmetabolismus

4 Pharmakologie zu Pharmakogenomik
Entwicklung und Bereitstellung von Wirkstoffen, die es ermöglichen gesund zu werden oder zu bleiben. Probleme: Wirkstoffentwicklung ist teuer Rationale Wirkstoffentwicklung ist schwierig Wirkstoffe werden für “Durchschnittsbürger”entwickelt % non-responders ~ Todesfälle in den USA pro Jahr Frauen Kinder Pharmakogenomik!? Lösung: Wirkstoffe für bestimmte Gruppen von Individuen entwickeln und anwenden; Verlangt die Zuordnung von Individuen zu diesen Gruppen.

5 Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung
Ziele: Verständnis von Krankheitsmechanismen  Drug Targets Biomarker Marker für Toxizität und Wirksamkeit Marker für Differentielle Diagnostik  Unterstützung von Therapie-Entscheidungen Disease Genes: Gene expression, mapping, associations, functional analysis Toxicology: Gene expression, cell based assays Efficacy and drug response: Association, gene expression, mapping

6 Pharmakogenomik & Wirkstoff Entwicklung
Phase I Phase II Phase III Phase IV Sicherheit, Wirksamkeit, Dosisfindung Klinische Studien: Wirkstoff-Screening & Kandidaten-Identifikation in vitro Validierung in vivo Validierung Toxikologische Analyse Präklinische Forschung: Biologie & Medizinische Forschung Identifizierung von Drug Targets Klinische & Biologische Krankheitsmodelle Identifizierung von „Krankheitsgenen“ & -mechanismen Grundlagen- & Pharmazeutische Forschung: Individualisierte Medizin Disease Genes: Gene expression, mapping, associations, functional analysis Toxicology: Gene expression, cell based assays Efficacy and drug response: Association, gene expression, mapping

7 Rationale für Pharmakogenomik
Alle Erkrankungen beruhen zumindest teilweise auf Veranlagung … Erbanlagen Umwelteinflüsse Hämophilie Down-Syndrom HFI Lungenkrebs Motorradunfall Knochenbrüche Diabetes Asthma Rheumatoide Arthritis Infektionskrankheiten ...

8 Spielen Genetische Ursachen eine Rolle?
Zwillings und Geschwisterstudien Genomweite Kartierungsstudien Mechanistische Studien Kandidaten-Gen Assoziationsstudien Tiermodelle Zur Identifizierung von: Im Krankheitsgeschehen implizierten biologischen Prozessen Wirkstoff Targets Diagnostischen Markern Toxikologischen Markern

9 Zwillingsstudien 3 1 4 2 1 … Einfluss der Umweltbedingungen
2 … Einfluss zufälliger Größen 3 … Einfluss von Umwelt und Genen 4 … Einfluss der Veranlagung Durch den Vergleich der Häufigkeit des Auftretens der Krankheit bei Geschwistern unter verschiedenen Bedingungen lässt sich die Rolle der Veranlagung abschätzen.

10 Genomweite Kopplungskartierung
1cm ~ 1Mbp

11 Mechanistische Untersuchungen
                                                                                                    1cm ~ 1Mbp

12 Kandidatengen-Assoziationsstudien
Genetische Variation Komplexe Phänotypen Morphologie Expression: Gene, ncRNA Umwelt Proteom Epigenetik Spielen Varianten eines Gens eine Rolle in einer Erkrankung?

13 Variable Elemente des Genoms
Chromosomenaberrationen Mutationen Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Insertionen und Deletionen Copy Number Variation Repeats (meist nicht kodierend) Megasatelliten (mehrere kbp, Blocks bis 100e kbp) Satelliten (5-171 bp, Blocks 100 kbp bis Mbp) Minisatelliten (6-64 bp, Blocks 0,1 – 20 kbp) Microsatelliten (1-4 bp, Blocks bis 150bp) Repetitive kodierende DNA “Variable Number Tandem Repeats” (VNTRs) “Transposable Elements”

14 SNPs und Humane Genetische Variabilität
~ 3 Mrd. Basenpaare ~ 99.9 % Identität zwischen Individuen ~ 3 Millionen Basenunter schiede zwischen Individuen SNP... Single Nucleotide Polymorphism ACGTCTATGCATAGCTAG TGCAGATACGTATCGATC ACGTCTATTCATAGCTAG TGCAGATAAGTATCGATC

15 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien
Clinical Problem Clinical Study Clinical-Biological System Candidate Genes Analysis & Gene Selection Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Genotype Data Assay Design & Genotyping SNP Retrieval Clinical Data Research into Causations Drug Targets Verification Studies Personalized Medicine Diagnostics Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Find the best candidate genes Select SNPs for genotyping Set up experiments efficiently Keep all information organized Analyze data meaningfully

16 Identifizierung von Kandidatengenen
Funktionelle Biologie/Biochemie Genetische Kartierung Proteomik “Krankheits Loci” Genfunktion Kandidatengene Genexpression Studien in Tiermodellen

17 Datenbanken mit Information zu Gen-Eigenschaften

18 Umfassende (automatisierte) Literatur Analyse

19 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien
Clinical Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Clinical Problem Clinical Study Clinical-Biological System Candidate Genes Analysis & Gene Selection Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Genotype Data Assay Design & Genotyping SNP Retrieval Find the best candidate genes Select SNPs for genotyping Set up experiments efficiently Keep all information organized Analyze data meaningfully

20 Identifizierung, Bewertung und Auswahl von SNPs
Ausgewählte SNPs sollten: Die häufigsten Varianten eines Gens detektieren Mit hoher Wahrscheinlichkeit Einfluss auf die Funktion des Genproduktes haben

21 SNPs zur Detektion Wichtiger Genvarianten
Die Haplotyp-Struktur des Genoms: Barrett JC, Fry B, Maller J, Daly MJ. Haploview: analysis and visualization of LD and haplotype maps. Bioinformatics Aug 5

22 Funktionelle Veränderungen durch SNPs
Nebenbei: Einblick in die Evolution

23 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien
Clinical Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Clinical Problem Clinical Study Clinical-Biological System Candidate Genes Analysis & Gene Selection Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Genotype Data Assay Design & Genotyping SNP Retrieval Find the best candidate genes Select SNPs for genotyping Set up experiments efficiently Keep all information organized Analyze data meaningfully

24 Genotypisierungsmethoden
Sequenzierung Minisequenzierung Pyrosequenzierung Single Base Extension (SBE) TaqMan Invader MLPA Hoch- und niedrigdichte Oligo-DNA Hybridiserungsarrays Allelspezifische Primerextension Allelspezifische Enzymreaktion 384-sample- Anchorchip™ (microtitre plate compatible) Allelspezifische Hybridisierung Die verschiedenen Detektionsmethoden basieren vor allem auf: Fluoreszenz Massenspektrometrie Chemolumineszenz Fluoreszenzpolarisation

25 Genotypisierung - Single Base Extension
ddNTPs C T A PCR product SBE primer Biotin G Single base Extension SBE primer G Streptavidin Product Purification G UV SBE primer Photocleavage 384-sample- Anchorchip™ (microtitre plate compatible) +G MALDI-TOF MS

26 Aufbau Genetischer Assoziationsstudien
Clinical Data Statistics / Data Mining Pattern Recognition Associations Clinical Problem Clinical Study Clinical-Biological System Candidate Genes Analysis & Gene Selection Candidate SNPs SNP Evaluation and Selection SNP Short List Genotype Data Assay Design & Genotyping SNP Retrieval Find the best candidate genes Select SNPs for genotyping Set up experiments efficiently Keep all information organized Analyze data meaningfully

27 Daten Analyse – Wie sehen die Daten aus?
Klinische Daten Genetische Daten

28 Analyse Einzelner Polymorphismen
Vergleich von Allelfrequenzen mit Chi-Quadrat Analyse Vergleich von Genotypfrequenzen mit Chi-Quadrat Test auf Hardy-Weinberg-Gleichgewicht (HWE) Vererbung berücksichtigende Tests Transmission Disequilibrium Tests (TDT) Affected Family Based Controls (AFBAC) Genetisches Relatives Risiko (GRR) ...

29 Musteranalysen “Clinical Bar Codes” “Genetic Bar Codes”
Patient 1 Patient 2 Patient 3 Schrittweise Progressive Regression Klassifikation (Support Vector Machines, Neuronale Netze) Mustererkennung

30 Herausforderungen bei der Analyse der Genetik Polygener Phänotypen
Phänotyp-Bestimmung Sehr geringe Penetranz einzelner Genvarianten (Common Disease – Common Variant vs. Common Disease – Rare Variant ) Geringe Penetranz von Haplotypen Genomweite Variantenmuster (GVPs) GVP-Subgruppen für einen Phänotyp Erreichen genomweiter statistischer Signifikanz

31 Genomweite Studien

32 Bekannte Assoziationen

33 Polygenische Erkrankungen
Rhesus hemolytic disease: - interaction of 2 mendelian loci: D and ABO - relatively simple and well understood Hirschsprung Disease: - absence of ganglia in the large intestine or colon - so far 5 loci implicated Breast Cancer: - now segregated into a rare near-mendelian form (BRCA1 & 2) and a more common sporadic form Type 1 Diabetes Mellitus: - autoimmune destruction of pancreatic b-cells - strong association to HLA-DR3 & DR4 alleles - strong association to non-Asp in DQB1 pos. 57 - Monozygotic twin concordance 30 %

34 Pharmakogenetischer Test
Warfarin “Blutverdünner” z.Bsp. bei Schlaganfallrisiko Stärkere Reaktion bei ca. 1/3 der Patienten 25 % Varianten im Vitamin K Epoxidreduktase Komplex 1 Gen (VKORC1) 10 % Varianten im Cytochrom P450 (CYP2P9) Ca. 2 Mill neue Patienten pro Jahr Individuelle Anpassung der Dosierung durch “Trial & Error” Alter Gewicht Ernährung Medikamente Genetik FDA: genetische Tests könnten Pro Jahr Blutungsereignisse verhindern Pro Jahr Schlaganfälle verhindern Am durch die FDA in den USA zugelassen

35

36 Phänotyp - Genotyp Analyse der Rheumatoiden Arthritis
Autoimmunerkrankung: Progressive Gelenkzerstörung Etwa 1% der Bevölkerung betroffen Lebenserwartung um Jahre reduziert Ätiologie nicht genau bekannt Genetische Suszeptibilität 30-60%

37 Warum sollte die RA-Genetik untersucht werden?
Verständnis der biologischen Prozesse in Ätiologie und Pathogenese  Neue Behandlungsstrategien Frühdiagnose  Therapieentscheidungen Differentialdiagnose Voraussage der Progression

38 Rheumatoid Arthritis - Etiology and Pathogenesis
TNF IL-1 Dinarello C.A., Moldawer L.L. Amgen 1999, Proinflammatory and Anti-inflammatory Cytokines in Rheumatoid Arthritis; with Modifications by Ulrich Sack Synovial membrane Lining cells T-cells, M T-cells & B-cell activation unknown antigens other risk factors genetic predisposition Activation Adhesion Permeabilization Migration of inflammatory cells Pannus formation Production of Collagenases (MMPs) by fibroblasts, chondrocytes and osteoclasts Joint destruction Cytokines Mediators

39 Kopplungs-Loci und Kandidatengene in RA
Il2 IL6R PRG4 CD8A IL18R1 CTLA4 IL5R CCR5 CSF2;Il4; Il5; Il13; IRF1 IL6 CRH HSPA1L; LTA; LTB, MICA PRL HLA Linkage Likely Linkage Possible No linkage

40 Unsere Bisherigen Resultate
Suszeptibilitätsanalyse rheumatoide Arthritis: ~180 SNPs in ~50 Kandidatengenen Genotypisierung in 500 Proben  > Genotypen Kapazität: ~3000 Genotypen pro Tag >98% erfolgreiche Genotypisierung <0.1% falsche Bestimmungen (PedCheck)  mehrere mögliche Assoziationen einzelner SNPs  einige Assoziationen konnten bestätigt werden Geninteraktionsanalyse läuft

41 Genotypisierung - TaqMan

42 Genotypisierung - Weitere Techniken …
Invader Assay Pyrosequencing