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Veröffentlicht von:Conradine Schröder Geändert vor über 10 Jahren
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maximal methodisch
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Durchflusszytometrie (2): DNA-Gehalt- und Zellzyklusmessungen Stephan Lobitz Klinik für Pädiatrie m.S. Onkologie und Hämatologie (CVK) +
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Wofür braucht man das ? Bestimmung des Chromosomensatzes einer (Misch-) Population (Euploidie, Aneuploide, Polyploidie) Veränderungen im Zellzyklus, z.B. - Tumorzellen mit erhöhter Proliferationsrate - DNA-Reparaturerkrankungen, z.B. Fanconi- Anämie mit typischem G2-Arrest
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Zellzyklus
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DNA-Färbung: Grundprinzip
Der fluoreszierende Farbstoff Propidiumiodid interkaliert in DNA In einem gewissen Bereich geschieht das stöchiometrisch => Je mehr DNA, desto mehr Fluoreszenz
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(Ein) Protokoll Man nehme: 70 % Methanol (EISKALT!!!)
RNAse-Stocklösung (1 mg/ml) Propidiumjodid-Stocklösung (1 mg/ml) PBS mit 2 % FKS 1 diploider Standard als Kontrolle
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(Ein) Protokoll Zellen pelletieren
Unter starkem Vortexen mit eiskaltem Methanol überschichten und 1 Stunde fixieren Zweimal mit PBS/FKS waschen, zählen und 1 Mill. Zellen in ein FACS-Röhrchen geben Erneut pelletieren
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(Ein) Protokoll Pellet in 425 µl PBS resuspendieren
50 µl RNAse (1 mg/ml) zugeben 30 min bei 37°C im Dunkeln inkubieren 25 µl Propidiumiodid (1 mg/ml) zugeben Messen
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(Ein) Protokoll Beim Messen beachten: 50.000 events registrieren
Flow-Rate auf low stellen Max. 300 Zellen/Sekunde messen Beachten, dass DDM-Parameter aktiviert sind (dazu später mehr...)
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Wie war das nochmal mit dem FACSen?
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Partikel werden mit einem Laser beschossen
Detektor Was steck ich vorne rein? Was kommt hinten raus? Partikeleigenschaften
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Das gängigste Durchflusszytometer ist der FACSCalibur von BD
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Der Calibur hat zwei Laser
FL1 Roter Dioden-Laser ~635 nm SSC FL3 FL4 . Blauer Argon-Laser 488 nm FL2 Flow Cell FSC
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Roter Dioden-Laser ~635 nm
Der Calibur misst: Interne Partikel- komplexität (SSC) FL-1 FL1 Roter Dioden-Laser ~635 nm SSC FL3 FL4 . Blauer Argon-Laser 488 nm FL2 Flow Cell FSC FL-2 FL-4 FL-3 Partikelgröße (FSC)
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Umwandlung des Lichtsignals in einen Spannungspuls am Detektor
Laser Spannung Zeit Laser Spannung Zeit Laser Spannung Zeit
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Ein Spannungspuls kann nach 3 Kriterien ausgewertet werden
Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Volt 40 Zeit (µs) Pulsweite (W) = Dauer
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Warum ist das SOOO wichtig ????
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Weil die Software routinemäßig nur die Pulshöhe aufzeichnet
Pulsfläche (A) Pulshöhe (H) Volt 40 Pulsweite (W) Zeit (µs)
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Über Pulsweite und Fläche kann man aber Einzelzellen von Aggregaten unterscheiden...
Laser Laser Spannung Spannung Zeit Zeit Laser Spannung Spannung Laser Zeit Zeit Spannung Spannung Laser Laser Zeit Zeit
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- aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe
... denn Einzelzellen und Dubletten unterscheiden sich in Pulsweite und -fläche Pulsfläche (A) Volt Pulshöhe (H) Zeit (µs) Pulsweite (W) Pulsweite (W) - aber NICHT zwangsweise in der Pulshöhe
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Die Einzelzellbetrachtung ist bei Zellzyklusmessungen extrem relevant!!!
vs. Faktor Faktor 2
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Anders gesagt: 2 x G1 macht 1 x G2
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Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter
Zurück zum Problem: Die CellQuest-Software zeichnet routinemäßig nur die Höhe eines Pulses auf Die Lösung: Das Feld DDM-Parameter DDM = doublet discrimination
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(Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)
Es werden alle drei Parameter (Höhe, Weite, Fläche) aufgezeichnet - nicht nur die Höhe !!! (Four Colour darf dabei nicht gecheckt sein !!)
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Jetzt wird‘s richtig tricky! Gut AUFPASSEN!!!!!
Die THEORIE: G1: 1. Signal deutlich niedriger viel weniger Fläche 2. etwas kleinere Zellen etwas kürzere Dauer Zeit Spannung G2: 1. Signal deutlich höher viel mehr Fläche 2. etwas größere Zellen etwas längere Dauer Spannung Zeit Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal + größere Fläche
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Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal
Weiter gut AUFPASSEN!!!!! Einzellzellen G2: 1. Signal deutlich höher viel mehr Fläche 2. etwas größere Zellen etwas längere Dauer Spannung FL-3-Fläche Zeit G1: 1. Signal deutlich niedriger viel weniger Fläche 2. etwas kleinere Zellen etwas kürzere Dauer Zeit Spannung FL-3-Weite Dubletten, Aggregate und so: viel größer => viel längeres Signal
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Der Beweis, dass man die richtigen Zellen ausgewählt hat...
FL3-Höhe FL3-Fläche Linearer Zusammenhang zwischen Fläche und Höhe
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G1/G0 G2/M Dazwischen: S-Phase
Einzelzell- diskriminierung Der erwähnte lineare Zusammenhang G1/G0 CV als Gütekriterium G2/M Dazwischen: S-Phase Als besonderes Bonbon: Anfärbung der Mitose durch spezif. Anti-Histon-H3-Antikörper
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Auswertung der Daten I Innerhalb von CellQuest Vorteil: einfach und billig Nachteil: S-Phase wird falsch niedrig bestimmt (vgl. Dean PN, J Cell Biol Feb;60(2):523-7)
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Auswertung der Daten II: Spezial-Software, z.B. ModFit
G0/G1 G2/M S Wieder die Einzelzell- diskriminierung
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Ein Beispiel für Aneuploidie
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Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen
Verwendung anderer Farbstoffe z.B. 7-AAD statt PI (teurer und aufwändiger, aber schmaleres Emissionsspektrum), daher günstiger bei Benutzung weiterer Antikörper Darstellung der S-Phase durch BrdU-Pulsbehandlung
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Für Fortgeschrittene: Mehrparametrische Messungen
Anfärbung einer bestimmten Zellzyklusphase durch einen Antikörper (z.B. Mitose durch anti-Histon-H3) Trennung von Tumor- und Normal-population durch tumorspezif. Antikörper (z.B. Zytokeratinantikörper beim Colon-Ca)
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Weitere Infos und Software-download
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Nächstes Thema: Stephanie Krämer, Tierärztin (Nephrologisches Forschungslabor) „Einführung in das tierexperimentelle Arbeiten und gesetzliche Grundlagen“ Bitte haltet euch über die homepage auf dem Laufenden:
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